РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Об'єктом дослідження було обрано меристему коренів проростків гороху (Pisum sativum L.), сорт Інтенсивний (фото 2.1). В насінинах клітини меристеми кореня заблоковані і синхронно вступають в перший мітотичний цикл при індукції проростання. Насінини цього виду мають високу енергію проростання і їх схожість легко вирівняти за розміром, ступенем водопоглинання; розмір меристеми більший, ніж у інших видів рослин. Для синхронізації вступу клітин до першого клітинного циклу, насіння гороху відбирали за морфологічними ознаками: розміром, формою та кольором насінин, до замочування і після набубнявіння у воді протягом 40 хвилин. Далі насiння пророщували при 24+ 10 С у темряві, в стаціонарних умовах (контроль) та на кліностаті - 2 об/хв (дослід). Насінини пророщували в трубочках з фільтрувального паперу, змоченого дистильованою водою, в темряві в умовах повільного кліностатування. Об'єм доступної води для проростків на початку проростання помітно впливає на тривалість перших мітотичних циклів, і якщо він перевищує оптимальний, цикл продовжується, а ріст коренів гальмується. Тому в даній роботі при проведені експериментів значна увага приділялася тому, щоб надати оптимальні умови для пророщування насінин і таким чином виключити можливість впливу на проліферативну активність клітин інших факторів, окрім кліностатування.
Використання саме кореневих апексів пояснюється зручністю їх як об'єктів для вивчення клітинного циклу завдяки відносній простоті і чіткості їх анатомічної будови та швидкості росту.
За даними літератури [19] розмір меристеми кореня до прокльовування становить коливається від 0,9 до 1,3 мм (майже весь зародковий корінь складається з меристеми), у період від прокльовування до довжини кореня від 1,2 до 1,5 см меристемна зона має середній розмір 1,5 + 0,04 мм від кінчика кореня.
Фото 2.1. Дводобові проростки насінин гороху в контролі і при кліностатуванні.
Відомо, що клітини меристеми зародкового кореня гороху в сухому насінні заблоковані в G1-фазі і синхронно вступають в перший мітоз, і тому є зручною моделлю для вивчення G1 фази клітинного циклу. Досліджували клітини меристеми коренів гороху в процесі індукції проростання насінин до прокльовування (24 година проростання) та після прокльовування (30 година проростання), оскільки початок реплікації ДНК в клітинах меристеми кореня гороху через 30 години проростання насінин корелює з часом їх прокльовування, що є морфологічним критерієм початку S-фази [19].
2.2. Методи
2.2.1. Дослідження мітотичного індексу меристеми кореня проводили цитологічним методом на дводобових проростках гороху. Насіння пророщували на вологому фільтровальному папері 48 годин і відбирали з довжиною кореня від 15 до 20 мм, оскільки саме при такій довжині кореня відбувається пік мітотичної активності [19]. Відібране насіння пророщували як на повільному горизонтальному кліностаті, так і в контролі в ідентичних умовах. Через кожні 3 години ( через 3, 6, 9 і т.д. годин) відбирали фракції контрольного та дослідного варіантів. Фіксацію корінців проводили в оцтовому алкоголі (спирт : оцтова кислота (3:1)) протягом 1,5 год. Для контролю фіксували вихідний матеріал перед кліностатуванням (0 годин). Після фіксації корінці переносили в 700 етиловий спирт, а потім фарбували ацетоорсеїном [101]. Корінці на добу залишали у фарбнику, потім робили давлені препарати в краплі 45%-го розчину оцтової кислоти. Проглядали в світловому мікроскопі CARL ZEISS по 1 тисячі клітин у 6-8 меристемах кожного варіанту. Всі досліди виконано у 3 біологічних повторностях. Дані обробляли статистично за допомогою порограми BIO Software, Р<0,05.
2.2.2. Оцінка конформаційного стану хроматину клітин меристем. На даний час відомі речовини, що мають спорідненність з ДНК і здатні конкурувати з РНК-полімеразами за "вільні ділянки" в її молекулі: актиноміцин Д, акридиновий оранжовий (АО), олівоміцин, етідій бромистий тощо. Вони мають різні константи зв'язування з ДНК і характер цього зв'язку. Серед них у більшій мірі вивчено флуорохром АО, метод використання якого був детально розроблений Ріглером [19]. Встановлено, що залежно від умов проведення реакції флуорохромування можна досліджувати взаємодію ДНК з білками ядра, тобто структурні переходи в хроматині, ступінь його конденсації - деконденсації або вміст нуклеїнових кислот. При низькій концентрації (10-6М) барвник зв'язується з двохспіральними ділянками ДНК і інтеркалює між нуклеотидними парами. Він існує в мономірній формі з максимумами поглинання 494 нм і зеленої люмінісценції - 530 нм. При більш високій концентрації він зв'язується з фосфатними групами односпіральних ділянок, при цьому молекули АО взаємодіють між собою, утворюючи димери з максимумами поглинання 465 нм, і червоної люмінісценції - 640 нм.
Насiння гороху пророщували при 24+ 10 С у темряві при звичайних умовах (контроль) та на кліностаті при швидкості обертання механічної платформи навколо горизонтальної осі 2 об/хв (дослід). Через кожні 3-4 год протягом процесу проростання насіння від 20 зародків відділяли зону меристеми, розмір якої до набубнявіння насінини складав 1 мм, а при прокльовуванні - 1,5 мм апікальної частини кореня. Застосовували флуоресцентний барвник акридиновий оранжевий (АО), який при певних умовах флуорохромування взаємодіє з ділянками в молекулі ДНК, незаблокованими білками, тобто вільними для транскрипції РНК-полімеразами. При цьому інтенсивність зв'язування ліганда відбиває конформаційні зміни в структурі хроматину, які корелюють з активністю РНК-полімераз, інтенсивністю синтезу РНК та чутливістю хроматину до дії нуклеаз. Сукупність цих тестів свідчить, що мікрофлюориметричний метод визначення зв'язування АО може бути надійним показником функціональної активності геному. Реакцію флюорохромування проводили з ядрами, ізольованими з клітин меристеми, як описано раніше [19]. Для цього відокремлені меристеми 20 корінців кожного варіанту роздавлювали в ступці з буфером для ядер (ТРІС-НС1, цукроза,