РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Матеріали та умови проведення дослідів
Дослідження проводили на безпородних білих щурах-самцях масою 100-120 г, яких
утримували в стандартних умовах віварію.
Експериментальний цукровий діабет у щурів викликали введенням стрептозотоцину
фірми “Sigma” (США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла внутрішньочеревно.
Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку визначали з
використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія) [162]. В експериментах
використовували тварин із рівнем глюкози 14-16 ммоль/л.
Вплив L-аргініну, L-NAME та AG оцінювали in vivo: при введенні цих речовин per
os з питною водою щурам.
У експериментах in vivo з моменту індукції діабету тваринам per os вводилися
досліджувані речовини з питною водою : L-аргінін у концентрації 1,25 г/л
протягом 14 днів; L-NAME у концентрації 70 мг/л протягом 14 днів ; AG у
концентрації 1 г/л протягом 30 днів. Дослідження проводили в таких групах: 1.
Контроль (К); 2. К + L-аргінін; 3. К + L-NAME; 4. К + AG; 5. Діабет (Д); 6. Д +
L-аргінін; 7. Д + L-NAME; 8. Д + AG.
Нітрозування проводили у спеціальному сатураторі. При цьому через відновлений
дитіонітом натрію гемолізат пропускали оксид азоту, який одержували шляхом
відновлення нітроксильного іону при поєднанні розчинів NaNO2 та аскорбінової
кислоти [55].
Результати обробляли статистично, використовуючи коефіцієнт Ст’юдента [33].
Визначення концентрації глюкози глюкозооксидазним методом [162]
Принцип методу полягає в окисленні глюкози до глюконової кислоти з утворенням
пероксиду водню під впливом оксидази. Інтенсивність забарвлення відповідає
концентрації глюкози в крові.
Реактиви:
Реагент – суха суміш глюкозооксидази і пероксидази, одного з компонентів
хромогенної системи і складових фосфатного буфера.
Хромоген – водний розчин другого компонента системи.
Глюкоза – калібрувальний розчин з концентрацією 10 ммоль/л в присутності
стабілізатора.
Стабілізатор: 134 мг щавелевокислого натрію і 850 мг хлористого натрію
розчиняють у 100 мл.
Готували робочий розчин: до потрібного об’єму реагенту додавали розчин
хромогену у співвідношенні 100:1. Кров брали із хвостової вени щура. Для
одержання плазми до 0,1 мл цільної крові вносять 0,9 мл стабілізатора і
центрифугували при 3000 об/ 15 хв. з метою осадження еритроцитів.
Таблиця 2.1.
Розчин
Холоста проба
Калібрувальна проба
Дослідна проба
Н2О дист.
0,5 мл
0,5 мл
0,3 мл
Калібрувальний розчин глюкози, 10 ммоль/л
--
0,02 мл
--
Плазма
--
--
0,2 мл
Робочий реактив
3,5 мл
3,5 мл
3,5 мл
Через 20 хв. дослідну і калібрувальну проби фотометрують проти холостої при
довжині хвилі 670 нм. Розрахунок концентрації глюкози (в ммоль/л) в кожній
проводиться за своєю калібрувальною пробою за формулою:
де Е1 і Е2 – оптичні густини дослідної і калібрувальної проб; 10 – концентрація
глюкози в калібрувальному розчині, ммоль/л.
Визначення концентрації гемоглобіну [65]
Кров змішували з реактивом Драбкіна, що перетворює гемоглобін в
ціанметгемоглобін. Концентрацію ціанметгемоглобіну вимірювали фотометрично.
Реактиви :
а) розчин Драбкіна: NaHCO3 - 1 г; КСN - 0,05 г; K3[Fe(CN)]6 - 0,2 г;
дистильованої води - до 1,0 л.
Під дією залізосинеродистого калію гемоглобін окислюється до метгемоглобіну
(геміглобіну ), який потім перетворюється за допомогою ціаніду калію в
ціанметгемоглобін ( геміглобінціанід ).
Використовували розведення - 1 : 250 ( 0,02 мл цільної крові та 5 мл реактиву
). Через 20 хв., які потрібні для повного перетворення гемоглобіну в
ціанметгемоглобін, вимірювали екстинцію при довжині хвилі 540 нм і товщині шару
1 см проти води на спектрофотометрі. Отриманий показник оптичної густини (Е540)
множили на коефіцієнт 36,77 і отримували концентрацію гемоглобіну в цільній
крові у грам - процентах :
СНв = Е540 • 36,77 • 10 ( г /л )
Для визначення концентрації гемоглобіну у гемолізатах готували цитратну кров,
додаючи 0,7 мл 5,0% розчину цитрата натрію до 10 мл крові. Еритроцити відділяли
від плазми шляхом центрифугування при 3000 об/хв протягом 5 хв. Плазму
відсмоктували за допомогою шприца з довгою голкою. Еритроцити тричі промивали
охолодженим фізіологічним розчином (0,9% розчин хлористого натрію) при 3000
об/хв по 5 хв. Відмиті еритроцити гемолізували дистильованою водою, додаючи до
1 мл еритроцитарної маси 2 мл дистильованої води. Суміш збовтували протягом 10
хв. і центрифугували при 8000 об/хв для видалення стром еритроцитів. За
допомогою шприца з довгою голкою відбирали супернатант.
Для визначення концентрації гемоглобіну з отриманого гемолізату відбирали 0,02
мл, додають 5 мл розчину Драбкіна і через 20 хв. вимірювали екстинцію розчину Е
на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм.
СНв = Е 540 • 251 • 1,45 (мг/мл або г/л )
де 251 - розведення;
1,45 – коефіцієнт перерахунку.
Визначення кількості еритроцитів [65]
У визначеному об’ємі камери Горяєва підраховували під мікроскопом клітинні
елементи, а потім перераховували отриманий результат на 1 мкл крові. Кров
попередньо розводили з метою зменшення числа клітин, які будуть знаходитись в
одному полі зору під мікроскопом. Кров розводили пробірковим методом, який
запропонував Н.М.Ніколаєв. У попередньо висушену чисту конічну пробірку
відмірювали 4 мл рідини для розведення ( для еритроцитів це 0,85 - 3,0 % розчин
хлориду натрію, в який додавали 0,4 г на 1 л барвника : метиленового синього
або крезилового синього - для підфарбування ядер лейкоцитів і для легшої
диференціації клітин, що дуже важливо при великій кількості лейкоцитів), в яку
обережно видували 0,02 мл капілярної крові з антикоагулянтом.. Суміш ретельно
перемішували і заповнювали камеру.
Після заповнення
- Київ+380960830922