РОЗДІЛ 2. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкт дослідження
У роботі використовували мишачі макрофаги лінії J774.2, отримані з Інституту
Вільяма Гарвея (Лондон, Велика Британія), нормальні мишачі фібробласти лінії
NIH 3T3 та нормальні кератиноцити людини лінії HaCaT, отримані з Людвігівського
інституту ракових досліджень (Уппсала, Швеція), трансформовані мишачі
фібробласти лінії L929, нормальні мишачі фібробласти лінії BALB3T3 та клітини
епідермоїдної карциноми гортані людини лінії
HEp-2, отримані з Інституту експериментальної патології, онкології та
радіології ім. Р.Є. Кавецького (Київ, Україна), а також клітини аденокарциноми
легені людини лінії А549, отримані з Інституту цитології РАН (Санкт-Петербург,
Росія). Клітини вирощували в середовищі Ігла в модифікації Дульбекко (Sigma,
США) із додаванням 10% сироватки крові ембріонів корів (Sigma, США) у
СО2-інкубаторі при температурі 37 °С, 5% концентрації СО2 і 100% відносній
вологості. Пересів клітин проводили у співвідношенні 1:5 через кожних 1 – 2
доби.
2.2. Змішані культури клітин
Клітини-мішені висівали у культуральні планшети або флакони і після їх
прикріплення додавали макрофаги у різних співвідношеннях. Для уникнення
безпосереднього контакту між клітинами в кокультурі, використовували спеціальні
лунки з мембраною з порами діаметром 0,4 мкм (BD Falcon, США), які поміщали в
культуральний планшет. Після певного часу спільного культивування клітини
аналізували за допомогою мікроскопа або розділяли за допомогою магнітних
кульок, як описано нижче, і використовували для подальших досліджень.
2.3. Цитоморфологічні дослідження
Клітини-мішені висівали на пластикові чашки і через 24 год до них додавали
макрофаги. Для дослідження фагоцитарної активності до вирощених у моношарі
макрофагів додавали суспензію живих клітин дріжджів виду Debarіomyces hansenii
(ВКМ Y-102), культивованих протягом 48 год на сусло-агаровому середовищі. Після
кокультивування макрофагів з клітинами-мішенями в середовище додавали акридин
оранжевий (Sigma) в концентрації 1,5 мкг/мл на 30 хв. Морфологічні зміни
досліджували за допомогою флуоресцентного мікроскопа ЛЮМАМ-Р2 (ЛОМО, Росія) при
збільшенні в 500 разів в області збудження 360-440 нм та емісії 480-700 нм і
фіксували на фотоплівці.
Для візуалізації F-актинових філаментів клітини, вирощені в моношарі на
предметному склі, промивали ФСБ, фіксували при кімнатній температурі 15 хв у 4%
розчині параформальдегіду у ФСБ та пермеабілізували 3 хв розчином, що містив
0,1% Тriton-X100 у ФСБ. Після промивання ФСБ клітини протягом 1 год при
кімнатній температурі в темряві інкубували з розчином, що містив 66 нМ
фалоїдину, кон’югованого з флуоресцентним барвником AlexaFluor 594 (InVitrogen,
США), та 1% БСА у ФСБ. Для візуалізації ядер клітини інкбували протягом 5 хв у
ФСБ з 1мкг/мл 4,6-диамідино-2-феніліндолу (DAPI) (Sigma). Після промивання ФСБ
на предметне скло з клітинами наносили середовище для тривалого збереження
флуоресценції GelMount (Sigma) та покривне скло. Клітини аналізували за
допомогою мікроскопа NIKON Eclipse E800.
2.4. Визначення проліферативної активності клітин
Клітини після імуномагнітного розділення із змішаних культур висівали у
24-лункові пластикові планшети в середовищі Ігла в модифікації Дульбекко
(Sigma, США) із додаванням 10% сироватки крові ембріонів корів (Sigma, США). Із
клітинами, культивованими окремо, також проводили маніпуляції з використанням
імуномагнітних кульок для забезпечення ідентичних умов експерименту. Підрахунок
кількості клітин після їх фарбування 0,1% розчином трипанового синього
здійснювали через певні проміжки часу в гемоцитометричній камері Горяєва.
Для визначення ефективності колонієутворення на чашку Петрі діаметром 3 см
засівали по 200 клітин і через 7 днів підраховували кількість колоній клітин.
Для візуалізації клітини фіксували 95% розчином етанолу і протягом 30 хв
інкубували з 5% розчином фарби Гімза (Sigma, США).
2.5. Визначення життєздатності клітин у змішаних культурах
2.5.1. Виявлення транслокації фосфатидилсерину на зовнішній бік плазматичної
мембрани та зміни її проникності
До клітин, культивованих у 96-лунковому планшеті, після видалення середовища й
промивання ФСБ у 100 мкл буферу для зв’язування (10 мМ Hepes/NaOH, pH 7,4, 140
мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2) додавали 5 мкл розчину кон’югованого з
флуоресцеїнізотіоціанатом (FITC) анексину V (BD Pharmingen), що зв’язується з
фосфатидилсерином [9], і 0,1 мкг 4,6-диамідино-2-феніліндолу (DAPI) (Sigma),
який проникає в клітини з пошкодженою мембраною та зв’язується з ДНК. Через 15
хв інкубації в темряві додавали 400 мкл буферу для зв’язування та аналізували
клітини за допомогою інвертованого флуоресцентного мікроскопа (Nikon Diaphot),
обладнаного CCD-камерою (QImaging Inc). Використовуючи об’єктив 20x,
підраховували кількість клітин щонайменше в шести полях зору в трьох
паралельних зразках. Щоб розрізнити клітини в змішаній культурі,
використовували барвник PKH 26 (Sigma) у концентрації 2 мкМ для попереднього
мічення клітин однієї з клітинних ліній.
2.5.2. Виявлення змін мітохондріального потенціалу
Для дослідження змін мітохондріального потенціалу використовували
дигідрородамін-123, який флуоресціює, окиснюючись в інтактних мітохондріях до
родаміну-123. 0,001%-ний розчин дигідрородаміну-123 (Sigma) додавали до клітин
і після 30 хв інкубації в темряві та промивання ФСБ клітини аналізували за
допомогою інвертованого флуоресцентного мікроскопа (Nikon Diaphot), обладнаного
CCD-камерою (QImaging Inc.). Для розрізнення клітин використовували мітку PKH
26 (Sigma). Використовуючи об’єктив 20x, підрахов
- Київ+380960830922