РОЗДІЛ 2
ОБ ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Обєкти досліджень
Об?єктами досліджень були листки, корені та хлоропласти рослин гороху Pisum sativum L., сорту Інтенсивний. Насіння гороху пророщували 36 годин на вологому фільтрувальному папері, потім закручували в трубочки з фільтрувального паперу та ставили на горизонтальний кліностат. Рослини росли протягом 7 та 14 діб при 16-годинному світловому режимі, температурі 25оС/20оС (день/ніч), вологості повітря 70%, освітленні 7000 люкс. Рослини поливали поживним розчином Кнопа. Контрольні рослини росли в аналогічних умовах за винятком кліностатування. В дослідженнях були використані гомогенати листів та коренів а також фракція хлоропластів (рис.2.1).
Рис. 2.1. Горох посівний (Pisum sativum L.)
Оскільки, в дослідженнях використовувалась фракція хлоропластів, було досліджено ультраструктуру клітин мезофілу листків рослин гороху, що зростали в контролі та за умов кліностатування. Відмічено, що хлоропласти мають типову структуру, характерну для них (рис. 2.2).
Рис. 2.2. Фрагменти клітин мезофілу листків 14-добових рослин гороху, що зростали в котрольних умовах (А, Б) та за кліностатування ( В, Г, Д) (К - крохмальне зерно, Пл - плазматична мембрана, Хл - хлоропласт)
В еліпсоїдних хлоропластах містилася розвинена система фотомембран, що складалася з тилакоїдів гран та тилакоїдів строми. В щільній стромі хлоропластів містилися зерна крохмалю та пластоглобули. Різниця між контрольним та кліностатованим матеріалом полягала в тому, що за умов кліностатування зростав об?єм тилакоїдів строми та пластоглобул і в більшій кількості накопичувався крохмаль.
2.2. Методи досліджень
Умови мікрогравітації в лабораторних умовах моделювали за допомогою повільнообертаючих горизонтальних кліностатів (2 об?хв, 2,7 ? 10-4 g) (рис.2.3).
Рис.2.3. Повільнообертаючий горизонтальний кліностат
Ультраструктурну організацію клітин листків гороху вивчали за допомогою трансмісійного електронного мікроскопу марки JEM 1200-EX. Для цього фрагменти листків спочатку фіксували протягом 1,5 години в 2,5% рзчині глютаральдегіду, приготовленому на 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,2. Потім зразки дофіксовували протягом 2,5 годин в 1% 0s04, приготовленому на тому ж буфері, зневоднювали у серії спиртів та ацетоні і заливали в суміш епон-аралдиту. Зрізи були отримані за допомогою ультрамікротому та контрастовані 2% розчином цитрату свинцю протягом 5 хвилин.
Щодо методів вивчення інтенсивності ПОЛ їх можна поділити на дві групи [18]. Перша група базується на вивченні молекулярних продуктів ПОЛ, зокрема гідроперекисів ліпідів, дієнових кон?югатів, малонового діальдегіду, шиффових основ та ін (рис.2.4).
Пероксидне окислення ліпідів
вільнорадикальні продукти та вільні ра-
молекулярні продукти ПОЛ дикали, що не є продуктами ПОЛ, проте
ініціюють та "ведуть" процес окиснення
гідроперекиси ліпідів LO.2 - пероксидний радикал
дієнові кон?югати LO. - алкілпероксидний радикал
малоновий діальдегід О2-. - супероксидний радикал
шиффові основи ОН. - гідроксильний радикал
карбонільні сполуки
полярографія, амперометрія, електронний парамагнітний резонанс,
спектрофотометрія, хемілюмінесценція
колориметрія, флуориметрія
Рис.2.4. Методи вивчення інтенсивності ПОЛ в клітинах та тканинах рослин
Сюди відносяться такі методи, як полярографія, амперометрія, флуориметрія, спектрофотометрія. Друга група методів грунтується на вивченні вільнорадикальних продуктів ПОЛ, а також вільних радикалів, що не є продуктами ПОЛ, проте ініціюють та "ведуть" процес пероксидації. Це методи електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) та хемілюмінесценції. Метод хемілюмінесценції є на 4-6 порядків більш чутливим щодо виявлення активних вільних радикалів в порівнянні з ЕПР . Так, за допомогою ХЛ можна зареєструвати наявність вільних радикалів у концентрації 103 в зразку, тоді як методом ЕПР - 1011 - 1015 [10]. В наших дослідженнях були використані методи обох груп: реєстрація інтенсивності хемілюмінесценції (спонтанної та люмінол-залежної) (вільнорадикальний рівень) та вивчення вмісту ТБКАП, що є одними з кінцевих продуктів пероксидації (молекулярний рівень). Дані методи були вибрані для отримання більш повної інформації щодо перебігу ПОЛ за умов кліностатування, ніж з використанням методів лише однієї групи, оскільки вони характеризують ПОЛ з різних сторін, тобто на вільнорадикальному та молекулярному рівнях.
Інтенсивність хемілюмінесценції визначали за допомогою хемілюмінометра ХЛМ1Ц-01 з детектором світіння ФЕУ-130. Для вивчення спонтанної (не активованої) хемілюмінесценції були використані лише корені; від зелених тканин сигнал СХЛ не реєструється, оскільки кванти світла поглинаються хлорофілом і за межі клітин не виходять [53]. Для визначення інтенсивності СХЛ відрізали головні корені рослин гороху довжиною 30 мм і в кількості 15 штук ставили в скляну кювету приладу. Фіксували кількість імпульсів за 2 хвилини. Після виміру СХЛ корені зважували і інтенсивність світіння перераховували в імп/хв на г сирої ваги.
Люмінол-залежна хемілюмінесценція обумовлена активними формами кисню [10], тому даний метод був використаний для вивчення утворення АФК в листках, коренях та хлоропластах гороху в контролі та за умов кліностатування. Для вивчення ЛЗХЛ був використаний люмінол у концентрації 10-2М для листків та 10-4М для коренів. Люмінол практично не змінює концентрацію АФК під час хемілюмінес