РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Зразки кордової крові.
У даній роботі представлено результати дослідження кордової крові доношених новонароджених 37-40 тижнів гестації від 28 породіль.
Зразки КК було отримано у пологових відділеннях медичних установ м. Києва, акредитованих на дану діяльність. Узяття КК проводилося медичним персоналом пологових будинків на основі інформованої письмової згоди жінки на надання матеріалу для дослідницьких цілей. Забір крові проводився з дотриманням правил асептики.
Кров збирали у стерильні скляні флакони, об'ємом 100 або 250 мл, що містили натрієву сіль гепарину (Белмедпрепарат, Білорусь), у кінцевій концентрації 20 Од/мл. Флакони заздалегідь герметизували і піддавали стерилізації в автоклаві при 1,2 атм. протягом 30 хвилин.
Транспортування матеріалу до місця подальшої обробки проводилося з підтримкою температурного режиму в межах 18-20?С. Час від здійснення забору КК до початку досліджень не перевищував 4-х годин.
Підрахунок кількості ядровмісних клітин кордової крові (ЯВК).
Кількість ЯВК у отриманих суспензіях і фракціях визначали загальноприйнятим методом з використанням камери Горяєва [6, 239]. При цьому клітини з суспензії набирали в лейкоцитарний меланжер до відмітки 0,5, потім доводили об'єм до відмітки 1,1 розчином 3% оцтової кислоти, струшували меланжер і четвертую краплю аналізували в камері Горяєва. Підрахунок проводили у 100 великих квадратах і розраховували за стандартною схемою [66].
Отримання мононуклеарної фракції клітин кордової крові.
З метою отримання фракції мононуклеарів КК у даній роботі використовували наступні методи:
- метод спонтанного відстоювання КК - в якості контролю;
- метод одноразового центрифугування у градієнті щільності Hystopaque (1,077 г/мл) (Sigma, США);
- метод дворазового центрифугування у градієнті щільності Hystopaque (1,077 г/мл) (Sigma, США);
- метод виділення мононуклеарній фракції у градієнті низької щільності Ficoll-Hypaque (1,065 г/мл) (Pharmacia Biotech, Швеція), із збором і відмиванням як інтерфазного кільця, що містить мононуклеари, так і розчину градієнта [240] (рис. 2.1).
Ефективність застосування кожного методу оцінювали за кількістю виділених ядровмісних клітин і кількості клоногенних попередників в агаровій культурі гранулоцитарно-макрофагального ряду (КУО-ГМ) [241].
Після доставки в лабораторію, з метою стандартизації умов експерименту, весь об'єм крові, отриманої від одного донора, розводили 1:1 розчином фосфатного буфера (PBS) (Sigma, США). Отриманий об'єм розділяли на 4 рівних частини для проведення паралельного дослідження із застосуванням чотирьох різних способів виділення клітин. Кінцевий об'єм клітинної суспензії у всіх чотирьох варіантах був однаковим.
При використанні методу спонтанного відстоювання КК, одну з чотирьох частин відстоювали при кімнатній температурі протягом 2-4 годин, поетапно знімаючи осаджувану лейкоцитарну плівку. Клітини концентрували центрифугуванням протягом 10 хвилин при 1000 об/хв. на центрифузі (Jouan, Франція). Підрахунок кількості ЯВК проводили у камері Горяєва, як описано вище.
Рис. 2.1. Схема експерименту з виділення мононуклеарної фракції кордової крові різними методами і подальшою їх характеристикою in vitro.
При використанні методу одноразового центрифугування клітин у градієнті щільності Hystopaque (1,077г/мл), КК, розведену 1:1 PBS, нашаровували на розчин Hystopaque, щільністю 1,077 г/мл у співвідношенні 2:1 і центрифугували при швидкості 1800 об/хв протягом 30 хвилин - стандартні умови.
Утворений у результаті шар плазми видаляли за допомогою пастерівської піпетки. Інтерфазне кільце, що містить клітини, збирали, піпетували і відмивали одноразово потрійним об'ємом культурального середовища DMEM (Sigma, США) з додаванням 15% фетальної телячої сироватки (FCS, Sigma, США) і суспендували у відповідному для даної серії експериментів об'ємі культурального середовища. Підрахунок ядровмісних клітин проводили в камері Горяєва, як описано вище. Готували цитопрепарати з використанням цитоцентрифуги Cytospin-3 (Shandon, Great Britain) і забарвлювали за Романовським-Гімза.
При використанні методу дворазового центрифугування у градієнті щільності Hystopaque (1,077 г/мл), на першому етапі виділення КК сепарували з використанням даного градієнта так, як описано вище. На другому етапі, плазму над інтерфазним шаром обережно знімали, а інтерфазне кільце разом із розчином градієнта до межі з еритроцитами збирали з використанням пастерівської піпетки. Отримані клітинні суспензії одноразово відмивали у потрійному об'ємі культурального середовища DMEM, що містить 15% FCS. Потім клітини знову нашаровували на розчин Hystopaque (1,077 г/мл) і центрифугували за стандартних умов, збирали, відмивали, підраховували, готували цитопрепарати і використовували для подальшого порівняльного аналізу.
Метод виділення мононуклеарної фракції у градієнті низької щільності Ficoll-Hypaque (1,065 г/мл) відрізняється від методу одноразового центрифугування у градієнті щільності Hystopaque (1,077 г/мл) тільки тим, що в даному випадку для отримання мононуклеарної фракції використовується Ficoll-Hypaque, щільністю 1,065 г/мл. Після центрифугування, клітини піддавали процедурам, описаним вище.
Приготування стромальних фідерних шарів.
Для визначення здатності строми кровотворних органів фетального походження до підтримки гемопоезу в культурі in vitro, готували два варіанти первинних стромальних фідерних шарів: з фетальної печінки людини (фідер ФП) 7-8 тижнів гестації і фетальної кісткової тканини людини (фідер ФК) 10-11 тижнів гестації.
Робота з фетальними тканинами проводилася відповідно до етичних принципів, схвалених комітетом з питань етики при Кабінеті Міністрів України, згідно з методичними рекомендаціями "Етичні питання та норми при роботі з ембріональними тканинами людини", затвердженими Міністерством охорони здоров'я України від 20 вересн