Морфофункціональні особливості мегакаріоцитів і тромбоцитів при мієлодиспластичному синдромі

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
У дослідах використовували аспірат кісткового мозку та тромбоцити крові осіб
без захворювань крові та з мієлодиспластичним синдромом.
Контрольну групу склали 16 осіб віком від 32 до 70 років без захворювань крові.
Групу з мієлодиспластичним синдромом склали 30 осіб віком від 22 до 75 років.
Діагноз мієлодиспластичний синдром встановлений на основі результатів
досліджень крові та кісткового мозку. За результатами аналізу крові виявлена
анемія та/або зниження кількості лейкоцитів і тромбо­цитів. При лікуванні
анемії стандартними методами позитивних змін не вияв­лено (рефрактерна анемія).
Дослідження пунктатів кісткового мозку показали наявність морфологічних змін
еритроцитарного та/або лейкоци­тар­ного і мегакаріоцитаного ростків
кровотворення.
Підгрупу з рефрактерною анемією склали 14 осіб з анемією, яка поєднувалась із
зменшенням кількості лейкоцитів та/або тромбоцитів. Підгрупу рефрактерна анемія
з кільцевими сидеробластами склали 2 особи, які мали специфічне забарвлення на
залізо еритроїдних попередників (гранули заліза розташовуються у вигляді кільця
чи напівкільця навколо ядра). В даній підгрупі анемія поєднувалась із
зменшенням кількості лейкоцитів та тромбоцитів. Підгрупу з некласифікованим
варіантом склали 14 осіб із зменшенням кількості тромбоцитів, лейкоцитів та,
іноді, з незначною анемією.
2.1. Кількісні методи досліджень мієлокаріоцитів та мегакаріоцитів кісткового
мозку
Методи оцінки кількості клітин кісткового мозку дають уявлення про
проліферативні процеси кровотворної тканини. Зменшення кількості
мієлокаріоцитів характерно для апластичних станів, збільшення - для захворювань
з високим проліферативним потенціалом (лейкози). Дані дослідження при
мієлодиспластичному синдромі дадуть змогу з’ясувати стан мегакаріоцитарного
ростка кровотворення в порівнянні з мієлокаріоцитами кісткового мозку.
Загальну кількість клітин кісткового мозку, які містять ядра (мієлокаріоцитів),
підраховували традиційним методом [51, 61]. Загальну кількість мегакаріоцитів
підраховували в камері Горяєва і обчислювали за формулою як викладено у [58,
61]:
Х*1,2=а*20/0,9 ,
де
кількість мегакаріоцитів в 1 мкл кісткового мозку;
кількість мегакаріоцитів в камері Горяєва;
20
розведення кісткового мозку (0,02 мл кісткового мозку вносили в 0,4 мл оцтової
кислоти);
0,9
об’єм камери Горяєва
Кількість тромбоцитів в крові визначали на геманалізаторі Sismex-F800.
Реактиви, які використані в роботі, представлені в табл. 2.1.
Розчини готували на дистильованій воді.
2.2. Морфологічне дослідження мегакаріоцитів на цитологічних препаратах
кісткового мозку
Вивчення будови клітин кісткового мозку дають змогу вия­вити зміне­ні клітин
кісткового мозку трьох ростків кровотво­рен­ня: еритроцитарного, лейкоцитарного
та мегакаріоцитарного.
Морфологічні дослідження мекгакаріоцитів проводили в цитологічних препаратах
кісткового мозку. Мазки кісткового мозку готували загально­прий­нятим методом
та фарбували за методом Романовського-Гімза [51].
Таблиця 2.1
Реактиви та речовини, що використовувалися в роботі
Найменування
Виробництво
Країна
ЕДТА-Na2, KH2PO4, КСl, МgCl2, NaCl, NaOH, Na2HPO4, NaWo4*2H2O, Na2MoO4*2H2O,
H3PO4, HCl, Li2SO4, Br2, трис, ацетон, метабісульфіт-Na, хлороформ, гексан,
диетиловий ефір
Химлаборреактив
Україна
Формалін, трихлороцтова кислота, бензол
УкрРеаХим
України
АТФ-Na2, АДФ-Na2, АМФ-Na2, сироватковий альбумін людини
Reanal
Угорщина
Колаген
Біокон
Україна
Оцтова кислота, фіксатор Май-Грюнвальда, азур-еозин за Романовським
Макрохім
Україна
Строфантин G
Дарниця
Україна
a-нафтилацетат, прочний синій RR, kit для визначення кислої фосфатази,
парарозанілін, перйодна кислота
Sigma
USA
Хроматографічні пластинки Silufol
Чехія
Підраховували 50-100 мегакаріо­цитів при збільшенні мікроскопа х1000.
Мегакаріоцити поділяли на такі групи. За ступенем зрілості: мегакаріобласти,
промегакаріоцити (кількість на 100 мегакаріоцитів), відсоток базофільних,
поліхроматофільних, оксифільних мегакаріоцитів (за ступенем спорідненості до
кислих та основ­них барвників) [61]; мікромегакаріоцити (клітини з
1-2-сегментованим ядром і розмірами клітини не більше 30 мкм), диспластичні
мегакаріоцити (1-сегментоване ядро оточене широкою цитоплазмою),
гіперсег­мен­товані мегакаріоцити (8 і більше сегментів ядра), мегакаріоцити з
фрагментацією ядра (сегменти ядра, які з’єднані тоненьким містком ядерного
матеріалу), мегакаріоцити з повною фрагментацією ядра (сегменти ядра не
з’єднані між собою) [41]. Підраховували мегакаріоцити, які утворюють тромбоцити
(функціонуючі мегакаріоцити), в залежності від ступеня зрілості клітин. На 50
мегакаріоцитів підраховували кількість "вільних" ядер мегакаріоцитів.
2.3. Морфологічне дослідження тромбоцитів на цитологічних препаратах крові
Морфологічні дослідження тромбоцитів проводили на цитологічних препаратах
крові. Препарати готували загальноприйнятим методом і фарбували за
Романовським-Гімза. Підраховували 100 тромбоцитів. За розмірами тромбоцити
поділяли на групи: малі клітини (2 мкм) - старі, середні (3 мкм) та великі -
(4-5 мкм) - зрілі клітини, гігантські тромбоцити (більше 5 мкм) - форми
стимуляції мегакаріоцитопоезу [42, 43]. За кількістю гранул тромбоцити
поділяли: без зернистості, з малою кількістю гранул (1-4), клітини з 5-8
гранулами, клітини, які містили 9 і більше гранул. Як окрему групу виділяли
незрілі форми - клітини з базофільною цитоплазмою.
2.4. Цитохімічні методи дослідження клітин кісткового мозку і крові
Цитохімічні дослідження клітин широко застосовують в світі для виявлення
належності