РОЗДІЛ 2.
Матеріали і методи досліджень
2.1. Матеріали та умови проведення дослідів
Для досліджень використовували тромбоцити здорових донорів та людей, хворих на
ЦД 1-го типу, із діагностованими ангіопатіями, а також кров’яні пластинки
щурів-самців масою 120-150 г. Експериментальний цукровий діабет у тварин
викликали введенням стрептозотоцину фiрми “Sigma” (США) з розрахунку 7 мг на
100 г маси тіла внутрішньочеревно. Розвиток діабету контролювали за вмістом
глюкози в крові, яку визначали з використанням набору реактивів “Lachema”
(Чехія) [173]. Від моменту індукції діабету тваринам з питною водою вводили
досліджувані речовини: L-аргінін (“Reanal”, Угорщина) у концентрації 1,25 г/л
протягом 14 днів; L-NAME (“Beckenham”, Велика Британія) у концентрації 70 мг/л
протягом 14 днів; AG (“Sigma”, США) у концентрації 1 г/л протягом 30 днів. В
експериментi використовували тварин із рівнем глюкози 14-16 ммоль/л.
Бактерії E.coli штаму XL-1 Blue (“Stratagene” США) вирощували в середовищі
Luria – Bertani (LB) з ампіциліном (0,05 мг/мл), а бактерії штаму BL-21 з
екстраплазмідою резистентності до хлорамфеніколу – в середовищі LB з додаванням
хлорамфеніколу та ампіциліну (0,02 і 0,05 мг/мл, відповідно) на шейкері при
370С. Для трансформації E. coli штаму Bl-21 використовували відповідні pGEX-2T
плазмідні вектори, люб’язно надані д-ром І. Гутом.
Для виконання експериментальної частини дисертаційної роботи були викopиcтaні
моноклональні анти-р85a антитіла, люб’язно надані д-ром І. Гутом (Людвігівський
інститут ракових досліджень, Лондон, Велика Британія), моноклональні анти-iNOS
антитіла (“Sigma”, США, №9657), анти-мишачі IgG, кон’юговані з пероксидазою
хрону (“Sigma”, США), нітроцелюлозна мембрана (“Osmonics”, США), реагенти для
підсиленої хемілюмінесценції (“Amersham”, Велика Британія) та набори реактивів
для виділення плaзмідної ДНК “NucleoSpin System” (“NT”, Велика Британія).
2.2. Отримання лізатів тромбоцитів [68]
Забір крові для отримання тромбоцитів проводили зранку (натще і до прийому
інсуліну) у силіконізовані пробірки, що містили 1/10 об’єму 3,8 %-ного розчину
цитрату натрію у якості антикоагулянту і 1,5 од/мл апірази (“Fluka”,
Швейцарія). Для отримання плазми, збагаченої тромбоцитами (ЗТП), кров
центрифугували при кімнатній температурі протягом 10 хв при 500 g. Обережно
відбирали супернатант і повторно центрифугували (500 g, 10 хв) для повного
осадження еритроцитів і лейкоцитів.
Частина отриманої ЗТП інкубувалася з вортманіном (“Sigma”) (кінцева
концентрація 100 нМ) протягом 30 хв при кімнатній температурі з постійним
перемішуванням.
Далі ЗТП підкислювалась 150 мМ лимонною кислотою до рН 6,5 з наступним
центрифугуванням 15 хв при 5000 g для осадження тромбоцитів. Тромбоцити двічі
промивали у 100 об’ємах середовища, що містило 137 мМ NaCl, 11 мМ глюкози, 11
мМ цитрату (рН 6,5), 0,25% бичачого сироваткового альбуміну (“Sigma”, IV
фракція, вільна від жирних кислот), 0,2 од/мл апірази. Лізис кров’яних
пластинок проводили протягом 30 хв на льодяній бані буфером такого складу: 10
мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1% тритон Х-100, 5 мМ ЕДТА, 5 мМ NaF, 1 мМ
фенілметилсульфонілфторид (“Fluka”, Швейцарія), 5 мМ бензамідин (“Sigma”, США),
10 мкг/мл апротиніну (“Sigma”), 10 мкг/мл лейпептину (“Sigma”), 2 мкг/мл
пепстатину (“Fluka”), 0,25 мМ Na3VO4 1:10 за об'ємом. Детергент-нерозчинну
фракцію осаджували центрифугуванням при 12000 g і 40С протягом 15 хв.
Визначення активності ферментів проводили в супернатанті.
Для визначення динаміки рівня регуляторної р85a субодиниці PI-3-кінази відмиті
тромбоцити ресуспендували у середовищі: 137 мМ NаСl, 2 мМ КСl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ
СаCl2, 0,4 мМ NaН2РО4, 5,6 мМ глюкози, 5 мМ HEPES
(4-(2-гідроксиетил)-1-піперазин-етансульфанілова кислота, “Sigma”, США) (рН
7,4), 1 од/мл апірази та інкубували з різними концентраціями ADP (“Sigma”)
(0,5мкМ; 1,0мкМ; 5,0 мкМ) за наступних умов: температура 370C, швидкість
перемішування 800 об/хв. Індукцію зупиняли через відповідні проміжки часу
додаванням холодного двократного буферу лізису. Отримані зразки до використання
зберігали при -700С.
2.3. Аналіз агрегаційної здатності тромбоцитів
Агрегаційну здатність тромбоцитів вивчали у збагаченій тромбоцитами плазмі,
використовуючи автоматичний аналізатор агрегації тромбоцитів (НПФ “Биола”,
Москва) згідно протоколу фірми-виробника [73]. Виміри здійснювались за
наступних умов:
температура – 37 0С,
швидкість перемішування – 800 об/хв,
концентрація тромбоцитів у пробі – 200 тис/мкл.
Індуктор агрегації ADP додавали до суспензії кров’яних пластинок об’ємом 0,3 мл
у кінцевій концентрації 5 мкМ.
2.4. Методи дослідження активностi ферментiв системи антиоксидантного захисту
та вмісту продуктів ПОЛ
2.4.1. Визначення супероксиддисмутазної активності [43]
Принцип методу визначення активностi СОД грунтується на здатності фермента
конкурувати з нітросинім тетразолiєм за супероксидні аніон-радикали, які
утворюються в результаті аеробної взаємодії NADH і феназинметосульфату. В
результаті цієї реакції нітросиній тетразолій відновлюється з утворенням
гідразинтетразолiю (нітроформазану). В присутності СОД відновлення нітросинього
тетразолію блокується. За кількістю нітроформазану - продукту відновлення
нітротетразолію синього - можна оцінити активність фермента. Реакцію проводять
при температурі 24-250С.
Реактиви:
Інкубаційна суміш, до складу якої входять 39 мМ ЕДТА-Na, 114 мМ нітротетразолій
синій (мета форма), 54 мМ феназинметасульфат, розчинені у 0,15 М фосфатному
буфері (рН=7,8).
Розчин NADH (152 мг NADH розчиняють в 100 мл трис- ЕДТА буферу рН=8,0).
Супероксиддисмутазну активність
- Київ+380960830922