РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали
Усі використані реагенти відповідали вимогам прийнятим для застосованих
методів. Солі і компоненти буферів кваліфікації "ос.ч." і "ч.д.а." або
сертифіковані фірмами виробниками для використаних цілей.
В роботі було застосовано наступні буферні системи та розчини:
Розчин АА (акриламід 30%, бісакриламід 0,8%); буфер для ультрацентрифугування
[183] (HEPES 50 мM, MgCl2 1 мM, EГTA 1 мM, в-меркаптоетанол 1 мM, KCl 75 мM,
коктейль інгібіторів протеаз “сomplete, mini” виробництва фірми Roshe,
Германія, згідно рекомендацій виробника); буфер для проведення реакції
фосфорилювання (HEPES 25 мM, MgCl2 3 мМ, NP-40 0,1%, pH 7,2); фосфатний буфер
PBS (NaCl 140 мМ, KCl 2,6 мМ, Na2HPO4 10 мМ, KH2PO4 1,8 мМ, pH 7,5); буфер TBST
(ТРІС-HCl 10 мM, NaCl 150 мM, Twin-20 0,05%, pH 7,4); тріс-гліциновий буфер для
ПААГ (ТРІС 25 мМ, гліцин 250 мМ ДСН 0,1%); буфер для електропереносу білків
(гліцин 39 мМ, тріс 48 мМ, ДСН 0,037%, метиловий спирт 20%); буфер МSB для
стабілізації мікротрубочок (MgCl2 2 мM, EГTA 2 мM, MES 20 мM,
поліетиленгліколь-6000 4%, pH 6,9); лізуючий буфер Лемлі [184] (ДСН 2%, тріс
63мМ, гліцерол 10%, в-меркаптоетанол 2%, pH 6,8).
Всі буферні системи та розчини було підготовлено використовуючи воду надвисокої
очистки, звільнену від органічних та неорганічних домішок, виробленою
сертифікованою системою очистки води. Контроль за рівнем рН здійснювали за
допомогою сертифікованої цифрової вимірювальної системи з комбінованим водневим
електродом, точністю до 0,01 рН.
Всі операції, пов’язані із приготуванням, зберіганням та транспортом хімічних
речовин і розчинів здійснювали з використанням високочистого пластикового та
скляного посуду, сертифікованого для роботи в біологічній лабораторії, кінчиків
для піпеток одноразового використання, одноразових гумових рукавичок та
широкодіапазонних автоматичних піпеток виробництва фірми “Eppendorf”. Для
роботи з культурами клітин використовували тільки готовий, одноразового
використання, стерильний пластиковий посуд.
Таблиця 2.1.
Використані в роботі антитіла
Антитіла
Посилання або виробник
TU-16 проти б-тубуліну
[185]
6-11В-1 проти ацетильованого б-тубуліну
Sigma-Aldrich (США)
GTU-88 проти g-тубуліну
Sigma-Aldrich (США)
HM2 проти БАМ-2c
Sigma-Aldrich (США)
HTF-14 проти трансферину людини
[186]
Ab1 проти ТК Src
Calbiochem (США)
Fyn проти ТК Fyn
Transduction Laboratories (США)
Lyn(44)-G проти ТК Lyn
Santa Cruz Biotechnology, Ink. (США)
N-19 проти білка Syk
Santa Cruz Biotechnology (США)
NF-09 проти білка нейрофіламентів NF-M
[187]
PY-20 проти фосфотирозину
Transduction Laboratories (США)
TU-01 проти б-тубуліну
[188]
TU-31 проти g-тубуліну
[189]
TUB-2.1 проти в-тубуліну
Sigma-Aldrich (США)
TUJ1 проти вIII-тубуліну
BAbCO (США)
анти-кролячі IgG антитіла, кон’юговані з пероксидазою хрону
Promega Biotec (США)
анти-кролячі, кон’юговані з ізотіоціанат флюоресцеїном
Jackson Immunoresearch Laboratories (США)
анти-мишачі IgG антитіла, кон’юговані з пероксидазою хрону
Promega Biotec (США)
проти б-актиніну
Sigma-Aldrich (США)
2.2. Робота з культурами клітин
2.2.1. Культивування клітин. У роботі були використані мишачі клітини ЕК лінії
P19 [178, 190-193]. До початку роботи клітини зберігали в банку клітин при
-80єС у консервуючому розчині з вмістом 10% диметилсульфоксиду. Клітини були
культивовані в базовому культиваційному середовищі для культур клітин ссавців,
підготовленому шляхом змішування модифікованого середовища Дюльбеко та
живильного середовища RPMI 1640, виробництва компанії "Sigma", (США) у рівних
співвідношеннях з додаванням 10% ембріональної бичачої сироватки, антибіотиків
пеніциліну (100 од/мл) і стрептоміцину (0,1 мг/мл). Культуру клітин, розміщену
у пластикові чашки Петрі культивували при 37?С в герметичних термостатах зі
створенням штучного газового середовища шляхом домішування 5% СО2 до
атмосферного повітря, з контролем вогкості та примусової конвекцією. Культуру
клітин висівали кожні два дні, використовуючи протеолітичний розчин (0,25% об.
трипсину, 0,01%-ного EДTA в фосфатному буфері PBS, pH 7,5).
2.2.2. Стимуляція клітин ретиноєвою кислотою. З метою індукції диференціації
[194] по нейрональному шляху в культурі клітин Р19, після посіву клітин у
кількості 105/мл клітинної маси формували агрегати клітин, нарощуванням в
мікробіологічних чашках Петрі. Після двох днів культивування агрегати клітин
м’яко осаджували і ресуспендували в культиваційному середовищі з додаванням РК
в концентрації 10-6 M та переносили в стерильні чашки для культури клітин,
діаметром 6 см. у кількості 105 клітин на чашку. Культиваційне середовище з РК
замінювали кожні два дні.
2.2.3. Блокування активності протеїнкіназ родини Src селективним інгібітором
РР2 в культурі клітин. Для блокування активності ферментів родини Src додавали
розчин селективного інгібітора РР2 [195] у диметилсульфоксиді до
культиваційного середовища із створенням кінцевої концентрації 10 нМ. В
подальшому це культиваційне середовище використовували як звичайно. До клітин,
які слугували контролем додавали диметилсульфоксид без вмісту інгібітора РР2 у
такій самій кількості.
2.3. Приготування екстрактів клітин
2.3.1. Приготування тотального екстракту клітин. Для приготування тотального
екстракту культуру клітин, агрегованих на чашках Петрі, після видалення
культиваційного середовища, тричі швидко промивали в фосфатному буфері PBS при
4?С та екстрагували в лізуючому буфері Лемлі у кількості 1 мл на чашку, після
зішкрябування гумовим шпателем екстракт переносили в пластикові пробірки
об’ємом 1,5 мл. і протягували 10 разів через ін’єкційну голку внутрішнім
д
- Київ+380960830922