РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали дослідження
В роботі були використані наступні плазмідні вектори сконструйовані для експресії в клітинах ссавців: pRc/CMV2, pcDNA3, pRc/CMV2/Rukl, pRc/CMV2/Rukm, pRc/CMV2/Rukh. Вказані вектори були люб'язно надані д-ром В. Бучманом (The University of Edinburgh, UK).
Анти-Glu-tag антитіла були люб'язно надані д-ром Л. Стефенсом (AFRC Babraham Institute, Cambridge, Great Britain).
Анти-Ruk антитіла були люб'язно надані д-ром І. Гутом, (Ludwig Institute for Cancer Research, London Division, Great Britain) та д-ром В. Бучманом.
Пpaймepи для субклонування Glu-tagged ізоформ Ruk були люб'язно надані д-ром І. Гутом.
[32P]-мічені 32-mer та 24-mer ОДН та 150-mer ОДН гену 5S рРНК Litechinus variagatus були люб'язно надані проф. Й. Ржешовська-Вольни (Institute of Oncology M. Sklodowska-Curie, Gliwice, Poland).
В роботі були також викopиcтaні анти-мишачі та анти-кролячі IgG, кон'юговані з пероксидазою хрону ("Sigma", США), анти-мишачі IgG, кон'юговані з FITC ("Pierce", США), розчини для ECL детекції ("Amersham", Велика Британія) та набори реактивів для виділення плaзмідної ДНК "NucleoSpin System" ("NT", Велика Британія) тa "Qіagen plasmіd kіt" ("Qіagen", Німеччина); набір реактивів для ПЛР фірми "Fermentas" ("Fermentas", Литва); набір реактивів для елюції фрагментів ДHК з aгaрoзнoгo гелю "QІАquіck gel extractіon kіt" ("Qіagen", Hімeччинa); набір реактивів для лігазної реакції "Takara ligaze kіt" ("Takara", Японія); набори реактивів для рестриктазних реакцій ("Fermentas", Литва); полівінілдифторидна (PVDF) мембрана ("Wathman", Велика Британія), ДНК з тимусу теляти ("Sigma", США), ДНК із сім'яників сперми лосося ("Sigma", США) та ДНК E. coli ("Sigma", США).
2.2. Умови культивування клітин
В роботі були використані клітини ембріональної нирки людини лінії HEK293 та клітини гістоцитарної лімфоми людини лінії U937, отримані з колекції клітинних культур Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ. Клітини HEK293 культивували в середовищі DMEM ("Sigma", США), а клітини U937 - в середовищі RPMI ("Sigma", США), що містило 10%-ну ембріональну сироватку телят ("GibcoBRL", Велика Британія), 2 мМ L-глутамін, 50 МО/мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину ("GibcoBRL", Велика Британія), в зволоженій атмосфері з 5%-ним СО2 при 370С. Клітини U937 пересівали при досягненні густини 1 млн/мл., а клітини HEK293 пересівали при досягненні ними 70-80%-тів субконфлюенту.
Інтенсивність росту клітинної культури оцінювали, підраховуючи кількість клітин в камері Горяєва. Морфологію клітин аналізували в препаратах зафарбованих за Май-Грюнвальдом Гімзом [5].
Бактерії E.coli штаму XL-1 Blue ("Stratagene" США) вирощували в середовищі Luria - Bertani (LB) з ампіциліном (0,05 мг/мл), а бактерії штаму BL-21 з екстраплазмідою резистентності до хлорамфеніколу - в середовищі LB з додаванням хлорамфеніколу та ампіциліну (0,02 і 0,05 мг/мл, відповідно) на шейкері при 370С.
2.3. Тимчасова трансфекція клітин лінії HEK293 Ca2+-фосфатним методом [207]
За 2-3 год до трансфекції клітини HEK293 розсівали на чашки Петрі діаметром 10 cм. до 30-50%-ів конфлюенту. До прикріплених клітин обережно додавали по краплях 1 мл свіжоприготовленої суміші такого складу: 61 мкл 2 М CaCl2, 0,5 мл 2-кратного HBS (137 мМ NaCl, 0,75 мМ Na2HPO4, 27 мМ HEPES ("Sigma", США), рH 7,0), 7-10 мкг плазмідної ДНК, стерильна вода до 1 мл.
Клітини культивували протягом 12-16 год, після чого міняли середовище на свіже з 10%-ами сироватки і проводили культивування протягом наступних 24-48 год.
Для трансфекції були використані наступні вектори: pRc/CMV2/Rukl-Glu-tag, pRc/CMV2/Rukm-Glu-tag, pRc/CMV2/Rukh-Glu-tag, pRc/CMV2.
2.4. Імунофлуоресцентна мікроскопія
Для імунофлуоресцентного аналізу клітини HEK293 культивували на предметних скельцях і трансфікували, як описано вище. Після досягнення 80-90%-ного конфлюенту клітини промивали ЗФР (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na2HPO4, 1,7 мМ KH2PO4, pH 7,3) і фіксували метанолом 10 хв при -200С. Вільні центри зв'язування на скельцях блокували протягом 30 хв 0,5%-ним сухим знежиреним молоком в ЗФР [136]. Детекцію рекомбінантних Glu-tagged білків Ruk здійснювали з використанням моноклональних мишачих анти-Glu-tag антитіл. Як другі антитіла використовували анти-мишачі IgG, кон'юговані з FITC. Отримані препарати аналізували під флуоресцентним мікроскопом "Axiohpot Opton EL-Elinsants 45-1887" ("Zeiss", Німеччина). Фотографії отримували за допомогою цифрової фотосистеми "Nikon Photomicrogrophic Attachment - Hamamatsu Color Chilled 3CCD Camera" ("Nikon", Японія).
2.5. Отримання клітинних лізатів [50]
Субконфлюентні культури клітин HEK293 і U937 промивали двічі ЗФР і лізували на льодяній бані в буфері, що містив 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мM NaCl, 1%-ний тритон X-100, 5 мM EДTA, 50 мM NaF, 1 мМ Na3VO4, 1 мМ фенілметансульфонілфторид (PMSF) ("Fluka", Швейцарія), 5 мМ бензамідин ("Sigma", США), 25 мкг/мл апротиніну ("Sigma", США), 10 мкг/мл лейпептину ("Sigma", США), 1 мкг/мл пепстатину ("Fluka", Швейцарія), протягом 20 хв Детергент-нерозчинну фракцію осаджували центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 15 хв, після чого супернатант переносили в чисту пробірку. Отримані зразки до використання зберігали при -700С. Для проведення електрофоретичного аналізу зразки лізатів, вирівняні за концентрацією білка, прогрівали при 950С протягом 5 хв в буфері Леммлі для зразків (62,5 мМ трис-HCl, pH 6,8, 1 мМ ЕДТА, 2%-ний додецил-сульфат натрію (SDS), 5%-ний ?-меркаптоетанол, 10%-ний гліцерин, 0,4%-ний бромфеноловий синій) [110].
2.6. Отримання ядерних екстрактів клітин НЕК293 та U937
Ядра клітин НЕК293 та U937 отримували згідно роботи [92]. Для цього до осаду клітин НЕК293 та U937 (6 х 106 клітин) додавали охолоджений на льоду гіпотонічний буфер, що містив 20 мМ трис-HCl, рН 7,4, 10 мM KC1, 2 мM MgCl2, 1 мM дитіотриїт та