РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження були проведені на 889 лабораторних білих мишах ліній СВА і СВАхС57,
612 морських свинках та 391 щурі лінії Вістар. Продуцентами антисироваток
слугували 5 собак та 115 кролів.
Для оцінки стану імунної системи лабораторних тварин визначали кількісний вміст
Т- та В-лімфоцитів у периферійній крові, кількість антитілоутворюючих клітин у
селезінці, титри гемаглютинуючих, гемолізуючих і преципітуючих антитіл у
сироватці та тривалість виживання шкірного лоскута при алотрансплантації.
Отримання суспензії лімфоїдних клітин. Тварин декапітували, лімфоїдні органи
(тимус, селезінку, лімфовузли) відокремлювали від жирової тканини та
подрібнювали шляхом протирання крізь металеве сито, фільтрували через
капроновий фільтр, відмивали 0,15 М розчином хлориду натрію і середовищем 199
(+4°С), а для проведення реакції локального гемолізу – розчином Хенкса.
Кількісне визначення Т-лімфоцитів у лімфоїдних органах. Вміст Т-клітин в
лімфоїдних органах мишей визначали у цитотоксичному тесті за допомогою
антимозкової сироватки. Реакцію проводили у середовищі 199 з робочим розчином
сироватки (трикратної концентрації), яка забезпечувала 100% загибель тимоцитів.
Кожне дослідження проводили у трьох пробах, результат усереднювали. Кількість
Т-клітин розраховували за формулою 2.1:
N т = (Nд – Nк) · 100%,
(2.1)
де Nд - кількість загиблих клітин у досліді;
Nк - кількість загиблих клітин у контролі.
Отримання антимозкової протимишачої кролячої сироватки. Антигенним матеріалом
слугував гомогенат мозкової тканини мишей лінії СВА [120]. Кролів імунізували
4,0 мл суміші 10% зависі тканини головного мозку у повному ад’юванті Фрейнда з
наступною двократною ревакцинацією за 14 діб. Ревакцинації проводили
внутрішньочеревним введенням 5,0 мл 10% зависі мозкової тканини двічі з
інтервалом у одну добу. Кров отримували на 6 добу після останньої ін’єкції.
Відокремлену антисироватку інактивували та виснажували свіжими зависями клітин
печінки, нирок, еритроцитами (8?кратно відмитими) та сироваткою крові мишей.
Ефективність виснажування перевіряли у цитотоксичному тесті з використанням
клітин тимуса, лімфовузлів та кісткового мозку. Зберігання сироватки протягом
одного року при +4°С не впливало на її активність.
Кількісне визначення В-лімфоцитів. Даний метод ґрунтується на здатності
В?лімфоцитів миші фіксувати комплекс “антиген-антитіло-комплемент” (ЕАС) за
допомогою поверхневих рецепторів цитоплазматичної мембрани [121].
Експерименти з ЕАС-розеткоутворення складалися з таких етапів.
Отримання еритроцитів, сенсибілізованих антитілами та комплементом. Еритроцити
барана тричі відмивали 0,15 М розчином хлориду натрію та готували 5% суспензію.
Рівні кількості 5% суспензії еритроцитів барана та стандартної кролячої
гемолітичної сироватки у субаглютинуючих титрах інкубували при 37°С протягом
30 хвилин при періодичному перемішуванні. Сенсибілізовані клітини відмивали
середовищем 199, а потім рівні об’єми сенсибілізованих еритроцитів та
розбавленого у 10 разів (1:10) мишачого комплементу інкубували при 37°С
впродовж 30 хвилин.
Проведення реакції ЕАС-розеткоутворення. 0,1 мл зависі лімфоїдних клітин (5·106
клітин у 1 мл) інкубували з 0,1 мл 2% зависі сенсибілізованих еритроцитів
барана при 370С протягом 30 хвилин, центрифугували при 1000 об/хв. (5 хвилин)
та підраховували кількість розеткоутворюючих клітин у камері Горяєва.
Кількісне визначення антитілоутворюючих клітин у селезінці мишей. Мишей
імунізували внутрішньочеревною суспензією еритроцитів барана у 0,15 М розчині
хлориду натрію в дозі 2·108 кл. на тварину. На 4 добу після імунізації тварин
умертвляли і готували суспензію спленоцитів. Визначення антитілоутворюючих
клітин у селезінці проводили в гелі за методом Єрне, як докладно описано у
методичних посібниках [122, 123]. Паралельно ставили контрольні реакції:
– агар з розчином Хенкса / 0,1 мл зависі еритроцитів барана;
– агар з розчином Хенкса / 0,1 мл клітинної зависі інтактної тварини /
/ 0,1 мл зависі еритроцитів барана;
– агар з розчином Хенкса / 0,1 мл клітинної зависі дослідної тварини / 0,1 мл
зависі еритроцитів барана.
Визначення реакції “трансплантат проти господаря” (РТПГ). Була використана
методика локальної РТПГ у лімфатичних вузлах, яка дозволяє за розмірами
останніх зробити висновок про активність реакції (А.І. Маянський,
А.Н. Мейліхова, 1976). Локальну РТПГ спостерігали в лімфовузлах мишей СВАхС57
за методом Twist V., Barnes R. (1973) [124]. Суть методу полягає у введенні у
пучку задньої кінцівки тварини зависі лімфоїдних клітин одного з батьків
(селезінки або тимуса у дозі 5·106) і визначенні на 7 добу ваги підколінного
лімфатичного вузла, який дренує ділянку введення клітин, та симетрично йому
розташованого інтактного лімфовузла. Для контролю використовували попередньо
прогріті при 56°С протягом 30 хвилин сингенні клітини. Життєздатність клітин
після прогрівання не перевищувала 3%. Активність РТПГ визначали за
співвідношенням ваги дослідного лімфовузла до ваги інтактного.
Вагу лімфовузлів визначали шляхом зважування на лабораторних терезах з точністю
до 0,05 мг.
Алотрансплантація шкірного лоскута. Шкірний клапоть трансплантували з хвоста на
спину тварини методом вільного лоскута [125]. Алотрансплантат фіксували
лейкопластирною пов’язкою, яку знімали на 7 добу. Реакцію враховували за
ознаками випадання волосся, наявності крововиливів (початок відторгнення),
утворення струпу та повної некротизації лоскута (кінець відторгнення).
Визначення титрів антитіл у сироватці крові мишей. Титри аглютинінів та
гемолізинів у сироватці крові мишей визначали при їх імуніза
- Київ+380960830922