РАЗДЕЛ 2
Основные направления,
материал и методы исследований
Объект исследований – поросята Полтавского мясного типа (ПМ-1) Учебно-научного
производственно-животноводческого комплекса Крымского государственного
агротехнологического университета. Поросята совместно со свиноматками
содержались в стандартных клетках типовых свинарников. В зависимости от ЖМ
новорожденных (суточных) поросят подразделили на три группы (І – 1463,33±54,92
г (n = 3), ІІ – 1073,33±45,55 г (n = 3), ІІІ – 766,67±40,82 г (n = 3)), а
поросят неонатального и молочного периодов по две: 5-суточных (І –
1713,33±270,68 г (n = 3), ІІ – 1183,33±100,58 г (n = 3)), 10-суточных (І –
2240,00±113,14 г (n = 3), ІІ – 1720,00±122,47 г (n = 3)), 20-суточных (І –
3513,33±244,19 г (n = 3), ІІ – 1900,00±110,45 г (n = 3)) и 40- суточных (І –
6167,67±71,10 г (n = 3), ІІ – 2406,66±155,56 г (n = 3)). Всего 33 головы. Для
морфологических исследований КО методом острого обескровливания проводили убой
животных.
Перед убоем, в стерильные пробирки отбирали кровь для морфологического и
биохимического исследований. В крови определяли: количество гемоглобина –
гемоглобинцианидным методом с ацетонциангидрином [192], эритроцитов и
лейкоцитов – в счетной камере Горяева [193], гематокрит – микрометодом в
модификации Й. Тодорова [191], общий белок сыворотки крови –
рефрактометрическим методом [192], общий кальций – трилонометрическим методом
[203], неорганический фосфор – с ванадат-молибденовым реактивом по Пулсу в
модификации В.Ф. Коромыслова и Л.А. Кудрявцевой [204].
После убоя путем анатомического препарирования отбирали необходимый материал
для исследования (табл. 2.1).Определяли АМ и ОМ костной системы, а так же
проводили морфометрические исследования отдельных КО: АМ КО, длина и плотность.
Плотность определяли по следующей формуле:
, (2.1)
где: Р – плотность, г/смі;
M – масса, г;
V – объем органа (по объему вытесненной воды), смі.
Таблица 2.1
Материал исследования
КО
Возраст, сутки
ВСЕГО
10
20
40
3-й шейный позвонок
33
8-й грудной позвонок
33
3-й поясничный позвонок
33
3-й хвостовой позвонок
33
8-е ребро
18
12
12
12
12
66
Последнее ребро
18
12
12
12
12
66
Грудина
33
Плечевая кость
18
12
12
12
12
66
Бедренная кость
18
12
12
12
12
66
Лучевая кость
18
12
12
12
12
66
Большеберцовая кость
18
12
12
12
12
66
3-4 пястные кости
36
24
24
24
24
132
3-4 плюсневые кости
36
24
24
24
24
132
ИТОГО
225
150
150
150
150
825
КО фиксировали при комнатной температуре в 5,0% растворе формалина в течении
2-5 суток (в зависимости от их величины), а затем в 10,0% растворе в течении
20-40 суток, в котором хранили их в период исследования.
Рентгенографию всей костной системы поросят проводили на рентгеновском
диагностическом аппарате 12П5 и радиографических рентгеновских пленках РМ-Д
помещенных в бумажные кассеты. Фокусное расстояние – 80 см, напряжение на
трубке – 45 кВ, анодный ток – 45 мА, экспозиция – 4-6 с.
Для исследования особенностей архитектоники компонентов КО проводили
макро-микрорентгенографию на аппарате рентгеновском “РУМ-17” и пленке
“Микрат-200” при следующих режимах: фокусное расстояние – 45 см, напряжение на
трубке – 150 кВ, анодный ток – 7 мА, экспозиция – 120 с. Рентгенограммы изучали
визуально и под стереоскопическим микроскопом МБС – 10 при увеличении 8х2, 8х4
и 8х7 в проходящем свете.
Для определения ОП ООк производили дифференцированный подсчет точек,
приходящихся на всю площадь рентгеновского изображения органа и на площадь его
ООк, при окулярных вставках для МБС – 10 по Г.Г. Автандилову [230]. Величину ОП
ООк вычисляли методом дифференцированного подсчета точек по формуле:
, (2.2)
где: S – относительная площадь очагов окостенения, %;
P1 – число точек, приходящихся на площадь очагов окостенения, шт.;
P2 – число точек, приходящихся на всю площадь рентгеновского изображения, шт.
Качественные характеристики и количественные соотношения тканевых компонентов
КО определяли при исследовании их тотальных гистотопограмм толщиной 25-30 мкм
(табл. 2.2). Тотальные гистосрезы изготавливали на микротоме-криостате МК-25-М,
при температуре в морозильной камере (–) 15-20 °С. Предварительно из
декальцинированных костей иссекали серединные пластины толщиной 5 мм, учитывая
анатомические особенности каждого костного органа: из тел позвонков вырезали
сагиттальные (вертикальные), а сегментов грудины – фронтальные пластины.
Трубчатые кости поросят предварительно разрезали на две половины (проксимальную
и дистальную). Срединные пластины из полученных участков иссекали в плоскости,
перпендикулярной суставному хрящу. При изготовлении тотальных гистосрезов
использовали модификацию методики разработанную П.Н. Гаврилиным [231, 232].
Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике
[233].
Морфометрические исследования гистотопограмм проводили при помощи
окуляр-микрометра МОВ-1-15 для микроскопа биологического “Биолам”, и
стандартных окулярных вставок для микроскопа МБС-10, по Г.Г. Автандилову
[230]. ОП ХТ, КТ, остеобластического, красного и желтого КМ определяли методом
“точечного” подсчета по формуле:
, (2.3)
где: S – относительная площадь ткани в органе, %;
T1 – число точек попавших на ткань, шт.;
T2 – число точек тестовой системы попавших на гистотопограмму, шт.
Таблица 2.2
Распределение материала по методикам исследования
Костный орган
Методики
морфометрия
рентгенография
гистологические
(гематоксилин-эозин)
3-й шейный позвонок
33
33
8-й грудной позвонок
33
33
165
3-й
- Київ+380960830922