РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Репрезентовані в роботі дані одержані на експериментальному та клінічному
матеріалі. Експериментальна частина дослідження, яка виконана в Інституті
експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН
України, присвячена вивченню біологічних ефектів ЕМВ НВЧ-діапазону в модельних
системах in vitro. В якості останніх використовували індикаторні бактеріальні
штами (Salmonella typhimurium), визначені у міжнародному протоколі вивчення
мутагенної (антимутагенної) активності різних чинників, а також лімфоцити,
виділені за допомогою стандартних методик з периферичної крові, лімфатичних
вузлів і тимусу, та перитонеальні макрофаги нелінійних щурів, щурів лінії
Вістар і мишей лінії Balb/с, які були одержані з віварію Інституту
експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН
України.
Клінічні дослідження, що представлені в дисертаційній роботі, було виконано на
базі клінічної лікарні № 16 м. Києва (головний лікар А.К. Куценко) та Київської
міської онкологічної лікарні (головний лікар Г.П. Олійниченко) МОЗ України;
клініко-імунологічні дослідження проведені на базі Київської міської
онкологічної лікарні МОЗ України (зав. відділенням імунотерапії пухлин к.б.н.
О.Д. Черненко), гістологічні – на базі клінічної лікарні № 25 (зав.
патогістологічною лабораторією к.м.н. В.С. Вятченко) та Київської міської
онкологічної лікарні МОЗ України (зав. патогістологічною лабораторією
Л.М.Захарцева), цитологічні – на базі поліклініки № 2 для дорослих
Шевченківського району м. Києва (зав. лабораторією Л.А. Духлій). Діагностику
інфекцій, що передаються статевим шляхом, за допомогою полімеразної ланцюгової
реакції здійснювали в спеціалізованому медичному центрі „Оптима” м. Київ
(директор к.м.н. І.А. Петрівська).
Детальна характеристика груп пацієнток та опис експериментальних і
клініко-лабораторних методик наведені у відповідних підрозділах.
Як в експериментальних, так і в клінічних дослідженнях використано прилад,
розроблений на радіотехнічному факультеті Політехнічного Університету (КПІ) –
"Політон-2" (автори В.І.Скачко, В.А.Куценок, Ю.К.Сидорук, В.В.Скачко) [50].
(Рис.2.1)
Прилад являє собою систему випромінювачів неполяризованих електромагнітних
хвиль шумового характеру у діапазоні від 40 ГГц (7,l - 7,5 мм) до довжини хвилі
450 нм, що відповідає червоному спектру оптичного діапазону. Тобто, прилад
випромінює шумові електромагнітні хвилі міліметрового, субміліметрового,
інфрачервоного і червоного діапазону одночасно. Генератором цих хвиль є тліючий
газовий розряд у спеціально підібраній газовій суміші. Рівень потужності потоку
випромінювання складає 10-18 Вт/Гц спектральної щільності. При такому рівні
повністю відсутній тепловий характер впливу на біооб'єкт, який використовується
при високочастотній терапії, гіпертермії та ін.
2.1. Метод оцінки впливу ЕМВ НВЧ-діапазону на ДНК модельних клітин.
Для визначення можливого пошкодження ДНК під впливом ЕМВ НВЧ як модель були
використані нормальні лімфоцити периферичної крові нелінійних щурів, які
виділяли шляхом центрифугування на градієнті густини фікол.-верографіну
(с=1,077) при 1,5 тис. об/хв протягом 20 хв. Однониткові розриви ДНК (ОНР ДНК)
визначали за методом Ангстрема і Еріксона [177] у модифікації Газієва А.І. [23]
– хроматографії на гідроксиапатиті (ГАП) [225].
Лімфоцити опромінювали in vitro у відкритих пластикових чашках Петрі протягом
10 хв, після чого двічі промивали цитратним буфером і осаджували
центрифугуванням при 460 g 1 хв. Осад суспендували в тому ж буфері, доводячи
концентрацію до 4-5х105 клітин/мл.
Для лізису у двох повторах брали по 0,2 мл суспензії клітин (приблизно 3 мкг
ДНК), які вносилися дозатором у флакони з лізуючим розчином (0,06 M NaOH, 0,01
M Na2HPO4, 0,9 M NaCl, pH-11,4-12,0). Флакони витримували в темряві при 20оС
строго 5 хв, суміш нейтралізували до рН 6,8 додаванням 2 мл 0,24 М
калій-фосфатного буферу (pH 6,8), що містив 8 М сечовини і 0,7 мл 0,1 М HCl.
Далі суміш обробляли ультразвуком протягом 15 сек на приладі УЗДН-Т (СРСР) при
частоті 22 кГц і переносили у пробірку з 2 мл 10 % ГАП. Вміст пробірки швидко
перемішували і центрифугували 5 хв при 1850g. Супернатант відділяли і до осаду
добавляли 4 мл 0,24 М калій-фосфатного буферу, що містив 8 М сечовини,
перемішували осад і знову центрифугували, як вказано вище. Супернатант (фракція
з однонитковою ДНК) збирали, а осад знову обробляли 4 мл 0,48 М
калій-фосфатного буферу (рН 6,8). Після центрифугування супернатант (фракція з
двонитковою ДНК) збирали.
Кількість ДНК у фракціях, що містили одно- і двониткову ДНК, визначали реакцією
з 3,5-диамінобензойною кислотою (ДАБК). Для цього в кожний супернатант як
співосаджувач додавали 0,1 мл 0,3%-ного розчину альбуміну і 2,5 мл холодної
35%-ної трихлороцтової кислоти (ТХОК). Осади формувалися протягом ночі при 4оС,
після чого центрифугувалися 15 хв. при 1850 g і промивалися холодною 5%-ною
ТХОК. Речовини, що заважають проведенню реакції з ДАБК екстрагували 0,1 Н
розчином ацетату натрію в етанолі на холоді протягом 20 хв. Потім осади
обробляли при 60оС абсолютним етанолом 30 хв і висушували при 60оС протягом 1
год. До кожного осаду додавали 0,03 мл 4 М розчину ДАБК (Sigma, США) у 4Н НCl.
Пробірки закривали і інкубували при 60оС 1 год. Потім у кожну пробірку додавали
1 мл 1Н соляної кислоти і вимірювали флуоресценцію при довжині хвилі 510 нм,
довжині хвилі збудження 405 нм на спектрометрі СДЛ-1 (СРСР).
Результати вимірювань виражали у відсотках кількості однониткової ДНК