РОЗДІЛ 2
ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали і методи
Робота виконана впродовж 2000-2003 рр. на базі кафедри патологічної анатомії НАУ, ветеринарної клініки для дрібних тварин "Медісан-К", наукової лабораторії Інституту екологічної патології людини і в лабораторії диспансерного відділення туберкульозної лікарні № 1 м. Києва.
Поширенність демодекозу собак в м. Києві вивчалася на основі аналізу звітності управління ветеринарної медицини м. Києва за 1999 - 2002 рр. і результатів власних досліджень, які були проведені на базі ветеринарної клініки для дрібних тварин "Медісан-К" протягом 2000-го року (Харківський р-н м. Києва).
Клінічне обстеження 697 собак різних порід і віку виконували загальноприйнятими методами. Починали зі збору анамнезу. Анамнез включав дані про вік, стать, породу та відомості про те, де і коли почалося захворювання, данні про перебіг хвороби, наявність та відсутність свербіння. При проведенні клінічного обстеження собак виміряли температуру тіла, пульс, кількість дихальних рухів. Температуру у тварин вимірювали ректально ртутним термометром. Аускультацію серця і легень проводили загальноприйнятими методами.
Оцінку стану шкіри здійснювали візуально, пальпаторно, методом глибоких зскрібків, бактеріологічними, хірургічними, гістологічними та гістохімічними методами.
Кров для досліджень брали з підшкірної вени передпліччя вранці до годування тварин. Як стабілізатор використовували гепарин.
Гематологічні показники 39 хворих на демодекоз і 30 контрольних клінічно здорових собак аналогічного віку і породи (кількість еритроцитів, лейкоцитів, ШЗЕ, лейкограму) визначали загальноприйнятими методами, вміст гемоглобіну - гемоглобін-цианідним методом. Лейкограму виводили з мазків крові, пофарбованих за Романовським-Гімза, при цьому підраховували 100 клітин.
Біохімічні дослідження крові тих же тварин проводили на біохімічному аналізаторі крові Humalyzer 2000. Проводили вимірювання загального білка, ?-амілази, загального білірубіну, аспартат-амінотрансферази, аланін-амінотрансферази, глюкози, сечовини, креатиніну.
Глибокі зскрібки шкіри від 174 собак з дерматозами різної етіології брали з кількох уражених ділянок лезом скальпеля до появи крові. Шкіру в області передбачуваного зскрібка попередньо міцно стискали для полегшення виходу кліщів з фолікулів. Зібраний матеріал переносили на предметне скельце, обробляли 10 %-м розчином КОН 5-10 хвилин і досліджували під світловим мікроскопом.
Біоптати для гістологічних і гістохімічних досліджень отримували згідно з розробленим нами методом.
Відібрані шматочки шкіри фіксували у 10 % - ному нейтральному розчині формаліну, 12 годин промивали проточною водою, проводили через спирти зростаючої міцності, витримуючи в кожній порції спирту 24 год., а далі через ксилол заливали у парафін. Зрізи товщиною 8 - 10 мкм одержували за допомогою санного мікротому.
Для гістологічних досліджень зрізи фарбували гематоксиліном та еозином. Для цього їх депарафінували у ксилолі 5 - 7 хв., проводили через 960 і 700 спирти та дистильовану воду, витримуючи в них по 3 хв. Потім зафарбовували зрізи гематоксиліном Караці 3 - 5 хв. і переносили у водопровідну воду, де вони повинні набути синього кольору (приблизно протягом 3 - 5 хв.). Потім зрізи переносили у 0,5 % розчин еозину на 1 - 2 хв., промивали у воді і проводили зневоднення у спиртах зростаючої міцності. (700, 960). У кожній порції етанолу зрізи витримували 1 - 2 хв. Просвітлювали зрізи в ксилолі 5 - 7 хв. і заключали у канадський бальзам під накривне скельце.
Для виявлення колагенових волокон застосовували метод Ван-Гізон [60]. Для цього зрізи депарафінували і доводили до води, як і при зафарбовуванні гематоксиліном Караці і еозином і зафарбовували у гематоксиліні Вейгерта 5 хв. Потім промивали зріз у воді, переносили його на 5 хв. в розчин щойно приготовленого пікрофуксину, знову швидко промивали у воді, зневоджували у двох порціях 960 етанолу (по 1 - 2 хв. у кожній порції). Потім просвітлювали у ксилолі 5 - 7 хв. та заключали в бальзам під накривне скельце.
Гістохімічними методами виявляли нуклеїнові кислоти (ДНК і РНК), білки, вуглеводні сполуки, глікозамінглікани.
Виявлення нуклеїнових кислот виконували за методом Ейнарсона. Галлоцианін - барвник оксазинового ряду. При кип`ятінні його з галунами утворюється хромовий краплак галлоціаніну у вигляді трьох комплексів: лак-катіон, лак-гідроксид і лак-сульфат. Взаємодіючи з нуклеїновими кислотами, лак-катіон утворює сольові зв`язки із залишками фосфорної кислоти нуклеотидів. Такий комплекс забарвлюється в темно-синій колір. Реакцію проводили наступним чином: депарафіновані зрізи доводили до дистильованої води, як і в інших методиках фарбування, потім забарвлювали в розчині барвника протягом 48 - ми годин при кімнатній температурі, промивали у воді, зневоджували в спиртах зростаючої міцності. Просвітлювали в ксилолі та заключали у бальзам [60]. Також використовували одночасне фарбування ДНК і РНК за В.Г. Конарєвським [60].
Методом Фельгена-Розенбека [60] виявляли ДНК. Початковою стадією реакції є гідролітичне розщеплення дезоксирибонуклеотиду на простий білок і нуклеїн. Нуклеїн (як правило, під дією 1Н розчину HCl) розщеплюється до простого білка та ДНК. Молекула ДНК поступово руйнується до мононуклеотидів - аденілової, гуанілової, цитиділової та тиміділової кислот. Далі проходить розщеплення зв`язку між основами (пуриновими та піримідиновими), дезоксирібозою та фосфорною кислотою. Звільнені внаслідок гідролізу молекули дезоксирибозо-5-фосфату та дезоксирибози можуть існувати (в залежності від вимог довкілля) як у напівацетальній, так і в окисній формах. Реакцію ставили наступним чином: парафінові зрізи доводили до води, потім занурювали в 1Н розчин HCl, переносили в реактив Шиффа на оптимальний час (0,5?1 год. за прописом де Томазі), промивали у 3 змінах сірчистої води по 2 хв. у кожній, потім промивали в дистильованій воді 2 хв. Зневоджували в спиртах зростаючої міцності, просвітлювали у ксило
- Київ+380960830922