РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ, ОБСЯГИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота присвячена скринінгу протимікробних засобів з різноплановою дією серед гетероциклічних хінолінових металоорганічних сполук. Всього вивчено 52 похідних хіноліну, вміщуючих в структурі хімічно високо реакційноздатні металоценові фрагменти. Вказані сполуки синтезовано для потреб різних галузей промисловості та охарактеризовано з фізико-хімічної точки зору В.І.Боєвим в Чернівецькому державному університеті
ім. Ю.Федьковича. Загальна структурна формула досліджених сполук слідуюча:
Mcn CH2 N+(CH3)2
CH2 CH2 N+
де Mcn = C5H5(Fe, Mn, Cu, Pb, Cr) C5H4
(металоценовий фрагмент)
Синтезовані речовини являють собою різнокольорові (переважно жовтого та фіолетового кольору) дрібні кристали з високою температурою плавлення (118-264 ОС), хімічну структуру їх підтверджено даними елементного аналізу, мас-спектрометрії, ультрафіолетового, інфрачервоного та видимих спектрів (табл. 2.1). Сполуки добре
розчинюються в полярних розчинниках (етанол, нітрометан), дещо слабкіше - в воді, не розчинюються в ефірі та бензолі; при нагріванні плавляться з розкладом, достатньо стійкі на повітрі і в розчинах.
В якості препаратів порівняння використано декаметоксин (декаметилен - 1-10-біс/ N-диметил-карбментоксіметиламоній/дихлорид) та етоній (дихлорид-етилен 1,2-біс/N-диметилкарбодецоксіметил/амоній), фероцерон, дифенгідрамін (протигістамінний засіб), 2,4-динітрохлорбензол (облігатний алерген).
З метою підготовки і розведення вихідних суспензій більшості взятих до досліду мікроорганізмів використовували пептонну воду (Peptone Water Maximum Recover diluent), pH 7,2, з включенням біо-трипкази (1,0 г на 1 л), що відповідає Міжнародному стандарту ISO 6887 (AFNOR).
Вилучення і ідентифікацію стафілококів проводили з використанням модифікованого нами манітол-солевого агару (рН 7,4) з включенням біо-політону, Д-манітолу та індикатора фенолового червоного (згідно вимог USPXXII, 1990). Характеристику гетерорезистентних штамів S.aureus визначали на агарі Мюллер-Хінтон-2 з 5 % NaCl (pH 7,3), що дозволяло вивчити стійкість мікробів до ?-лактамаз і метициліну (до 20 % клінічних штамів). З метою підвищення експресії метицилінової (гетерогенної) резистентності культивування стафілококів проводили на вказаному живильному середовищі при 30 ОС.
Диференціацію ?-гемолітичних стрептококів групи А (по Лансфілд) проводили за допомогою Bacitracin-Test, який базується на стійкості стрептококів щодо бацітрацину в дозі до 10,0 мкг/мл.
Ідентифікацію ентеробактерій проводили висівом на уреа-індольне (Urea-indole medium) середовище з вмістом L-триптофану, монокалію фосфату, дікалію фосфату, сечовини та індикатора фенолового червоного (рН 6,7). Принцип дії вказаного живильного середовища базується на прояві уреазної та триптофан-дезаміназної активності, а також продукції індолу з триптофану. Вказане живильне середовище використовували і для вилучення протеїв. Інтерпретацію результатів дослідження ентеробактерій різних груп за Означником бактерій Берджі, 1997 [85] на уреа-індольному живильному счередовищі проводили за показниками, які наведено в табл. 2.2.
Таблиця 2.2
Тести диференціації ентеробактерій на уреа-індольному середовищі
Найменування мікроорганізмівУреазаІндолТриптофано-дезаміназна активність1234Escherichia coli-+-Shigella dysenteriae, boіdii, flexneri-*-Shigella sonnei---Salmonella---S.arizonae SGIII---Citrobacter---Edwardsiella-+-Proteus vulgaris?+?Proteus rettgeri+++Proteus morganii-++Proteus mirabilis+-+Providencia-++Y.enterocolitica+*-Y.pseudotuberculosis+--Levinia-+-K. pneumoniae+ (заповіль-нено)--
Продовження табл. 2.2
1234K. oxytoca+ (заповіль-нено)+-Enterobacter aerogenes---Enterobacter cloacae---Enterobacter hafnie-*-Enterobacter aqqlomerans-*-Serratia marcensens---Serracia liqulfaciens---
Примітка: * - характерні особливості різних біохімічних типів
Для ізоляції клостридій використано TSN-агар, який вміщує триптазу, сульфіт і неоміцин. На вказаному живильному середовищі Cl.perfringens завдяки редукції сульфіту (при 46 ОС) колонії клостридій в анаеробних умовах формуються з поверхнею характерного чорного кольору.
Інші анаероби вилучали з використанням живильного середовища Шедлера (Schaedler-agar), виготовленого на соє-трипказному бульйоні з додаванням біо-політону, декстрози, трис(гідроксиметил)амінометону, ростових факторів - геміну, L-цистіну, вітаміну К3 (рН 7,3). Для більш чіткого прояву колоній Bacteroides melaninogenicus до агару Шедлера додавали 5 % крові вівці. Сальмонели вилучали на селективному хромогенному живильному чередовищі SMID, в рецептурі якого присутні біоплітон, жовчні солі, глюкуронат натрію, сорбітол, барвники нейтральний червоний і діамантовий зелений, а також хромогенні субстрати (галактопіранозид і глюкопіранозид). Колонії сальмонел на цьому живильному середовищі проявлялись за рожевим кольором, всі інші бактерії формують колонії пурпурового або голубого кольору (за виключенням S.arizonae, S.pullorum i S.gallinarum).
Паралельно з використанням середовища SMID для вилучення, ідентифікації і накопичення бактерій застосовували загальноприйняте збагачувальне середовище - Ф-селенітний бульйон (Selenite -F broth), який вміщував біо-політон, лактозу, фосфат натрію і кислий селеніт натрію. Вказане середовище використовували і для ізоляції шигел. Для вилучення дріжджеподібних грибів роду Candida використовували модифікований агар Сабуро (рН 6,4) з додатком біотіону, біотрипкази, біосої та папаїнового пептону, що дозволяло ізолювати гриби з патологічного матеріалу, деконтомінованого мікроорганізмами самих різних груп. Для послідуючого кількісного підрахунку дріжджів застосовували хлорамфеніколовий агар (0,1г хлорамфеніколу на 1 л живильного середовища) при глибинному засіві і вирощуванні при 25 ОС.
Про