РАЗДЕЛ 2
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТОВ И МЕТОДЫ ОБРАБОТКИ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1. Общая характеристика образцов и методы подготовки проб
Исследованный в работе синтетический ГА стехиометрического состава был получен методом химического осаждения [14,16]. Реакция проводилась между нитратом кальция и двузамещенным фосфатом аммония (Sigma):
10Ca(NO3)2+6(NH4)2HPO4+8NH4OH=Ca10(PO4)6(OH)2+20NH4NO3+6H2O
Использовали 1N водные растворы указанных солей, доведенные до рН 12 добавлением амиака (Sigma), причем раствор фосфата аммония по каплям вводился в раствор нитрата кальция. Полученный осадок оставляли на воздухе в течение суток, затем отфильтровывали, промывали дистиллированной водой, высушивали и измельчали.
При получении Mg-содержащего ГА в исходный раствор нитрата кальция вводили раствор нитрата магния в требуемых концентрациях.
Образцы стехиометрического и Mg-содержащего ГА были синтезированы в лаборатории НПП КЕРГАП (г.Киев). Образцы синтетических карбонатсодержащих апатитов были преданы для исследований из Института химии поверхности НАНУ (г.Киев), где были аттестованы как карбонатные апатиты соответствующих типов (А и В) методами инфракрасной спектроскопии и радиоспектроскопии.
Для исследования биоапатита различного происхождения были взяты следующие образцы компактной (кортикальной) кости: фрагменты диафиза хорошо минерализованной здоровой бедренной кости крупного животного (быка); остеопорозная бедренная кость курицы; кости голени лабораторных крыс. Образцы очищали механически, промывали в дистиллированной воде, сушили на воздухе. При необходимости подготовка образцов включала пиролитическое удаление органики, т.е. медленный нагрев на воздухе в кварцевой трубчатой микропечи до 750-850 K и выдержка при этой температуре 40-50 мин., до полного прекращения газовыделения.
Для рентгеноструктурного анализа использовали как плоские пластинчатые образцы (кость быка), так и порошки отожженной кости, соответствующие одной локальной области костного фрагмента. Порошки костного минерала, как и синтетического ГА, перед исследованием тщательно растирали в агатовой ступке. Ввиду того, что при исследовании костей мелких животных, количество порошкообразной пробы было очень мало, применяли следующую процедуру приготовления образцов. На поверхность пластинки технически чистого Al острым резцом наносили мелкую сетку. Затем на эту сетку медицинским шпателем помещали пробу. Окончательное формирование плотной и гладкой поверхности достигалось с помощью массивной стеклянной шайбы. Линии рентгеновской дифракции Al не имеют наложений с линиями ГА и ?-трикальцийфосфата, поэтому могут быть легко исключены при анализе.
В большинстве работ, посвященных рентгеноструктурным исследованиям апатита кости [51-55], использовали образцы в форме порошка. Это позволяло получать усредненные характеристики по всему объему, исследуемого костного фрагмента. Из-за анизотропии формы и преимущественной ориентировки кристаллов биоапатита [45,47,48,89,90], дифрактограммы порошка и ориентированного пластинчатого костного образца имеют некоторые отличия (Рис.2.1).
Методы исследования субструктуры поликристаллических материалов путем раздельного определения микродеформаций решетки и размеров кристаллов требуют не менее двух дифракционных линий, соответствующих различным порядкам отражения от одной и той же плоскости [59,91,92]. Две такие линии (002) и (004) есть на дифрактограммах ГА, однако, для биоапатита кости в случае хаотической ориентировки кристаллов (порошкообразные образцы), линия (004) вследствие размытия и перекрытия с соседними линиями для анализа не вполне пригодна (Рис.2.1).
Рис. 2.1. Картины рентгеновской дифракции пластинчатого образца кости, ориентированного перпендикулярно длинной оси кости (А) и порошка того же образца (В)
Природная текстурированность биоапатита приводит к усилению линий (002) и (004) для пластинчатых образцов, перпендикулярных длинной оси кости [45,89,90]. Таким образом, используя тот факт, что базисные плоскости гексагональных кристаллов биоапатита ориентированы главным образом перпендикулярно длинной оси трубчатой кости, совместный анализ профилей линий (002) и (004) при исследовании пластинчатых ориентированных образцов представляется вполне возможным.
Для исследования деминерализации образцы вырезали из диафиза бедра быка таким образом, что их анализируемые поверхность были перпендикулярны более длинной оси кости. Деминерализация проводилась при комнатной температуре в двухлитровом объеме раствора при постоянном перемешивании. Декальцинирующим агентом был 0.1 N водный раствор HCl. В течение процесса деминерализации pH раствора оставался постоянным (примерно 1.0), что свидетельствовало о стабильности условий препарирования. После обработки образцы были вымыты в дистиллированной воде и высушены на воздухе. Рентгендифракционные картины для одного и того же образца получали в ходе ряда последовательных процедур. Для оценки воспроизводимости результатов, в эксперименте в качестве образцов были использованы несколько смежных секций одного фрагмента кости. Анализируемая поверхность образца всегда была больше сечения зондирующего стабилизированного рентгеновского пучка, так что изменение интенсивности было обусловлено только потерями минерального содержания в образцах, но не сокращением их размеров.
Нагрев образцов при исследовании температурных характеристик проводили ступенчато в муфельной печи при температурах интервала от 873 до 1573 K (шаг - 100, 40 или 20 град) с последовательной регистрацией дифрактограмм. Стационарность условий и необратимость происходящих структурных преобразований обеспечивали медленным нагревом (0,04 град/с), выдерживанием при каждой фиксированной температуре около получаса и медленным охлаждением вместе с печью до комнатной температуры.
Для исследования методом рентгеновского микроанализа изменения соотношения Ca/P в биоапатите в ходе рекристаллизации