РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Матеріали
В роботі використовували п-нітрофенілфосфат (Sigma), лужну фосфатазу з тонких кишок теляти (активність 1,18 од./мг білка) (Fluka), L-цистеїн (Sigma), відновлений глутатіон (Serva), дигідроліпоєву кислоту, ліпоєву кислоту (Sigma).
Амінофосфонові кислоти були надані ст. наук. співробітником, канд. хім. наук Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України Т.М. Кашевою і синтезовані шляхом взаємодії відповідних альдегідів, тіосечовини і трифенілфосфіту в оцтовій кислоті. При цьому утворювались дифенілові естери, кислотний гідроліз яких приводив до вільних ?-аміноалкілфосфонових кислот [100, 101]. ?-Амінофосфонові кислоти одержували при гідролізі естерів кислот, які одержували з ?-кетофосфонатів відновлюючим амінуванням [102, 103].
Фосфорильовані калікс[4]арени були синтезовані в Інституті органічної хімії НАН України доктором хім. наук, проф. В.І. Кальченком та аспірантом С.О. Черенком циклізацією ?-заміщенних фенолів з формальдегідом. Cтруктура синтезованих сполук була доведена авторами за допомогою даних елементного аналізу, ПМР-спектроскопії, мас-спектрометрії.
Спектрофотометричний контроль за перебігом ферментативних перетворень здійснювали за допомогою спектрофотометра Specord M-40. Вимірювання рН проводили за допомогою приладів ОР-208/1 та рН-340. Використовували центрифуги РС-6 5000 об/хв, Т51 3600 об/хв. Отримані зразки препаратів ферменту зберігали визначений термін при охолодженні в холодильній камері Орск-115 при -180С.
2.2. Очистка препаратів лужної фосфатази
Очистка комерційного препарату лужної фосфатази включала гель-фільтрацію на Toyopearl HW-55 в натрій-ацетатному буфері (0,025 М, рН 5,5). Використовували хроматографічну колонку 1,7х40 см, врівноважену 0,025 М натрій-ацетатним буфером (рН 5,5). Розчин ферменту наносили на колонку і промивали тим же буфером до закінчення виходу білка, що не зв'язався з носієм. Потім проводили елюцію 0,025 М натрій-ацетатним буфером (рН 5,5). За виходом білка спостерігали, вимірюючи оптичну густину елюенту при ?=280 нм. Паралельно з цим контролювали ферментативну активність лужної фосфатази. Швидкість елюції становила 0,2 мл/хв, об'єм фракцій дорівнював 3мл. Результати гель-фільтрації наведено на рис. 2.1.
Рис. 2.1. Гель-фільтрація лужної фосфатази на Toyopearl HW-55. 1- активність ферменту, 2 - оптична густина при 280 нм.
2.3. Одержання гідрофільних і гідрофобних фракцій лужної фосфатази
Методика одержання гідрофільних і гідрофобних фракцій лужної фосфатази включала дві стадії: гель-фільтрацію на Toyopearl HW-55 в натрій-ацетатному буфері (0,025 М, рН 5,5) і гідрофобну хроматографію на октилсефарозі CL-4В. Колонку з октилсефарозою попередньо врівноважували 0,025 М натрій-ацетатним буфером (рН 5,5), який містив 20%-ний сульфат амонію. Слабо сорбований фермент елюювали в процесі промивки колонки тим же буфером до зникнення оптичної густини розчину при 280 нм. Елюцію білка, який зв'язався з октилсефарозою, проводили лінійним градієнтом сульфату амонію від 20% до 0% в 0,025 М натрій-ацетатному буфері (рН 5,5). Активність одержаних фракцій лужної фосфатази дорівнювала 1,7-3,0 мкмоль/хв на мг білка (трис-НСl буфер, рН 9,0, 250С).
Рис. 2.2. Гідрофобна хроматографія лужної фосфатази на октилсефарозі. 1- активність ферменту, 2 - оптична густина при ?=280 нм.
Результати гідрофобної хроматографії представлено на рис. 2.2. Як гідрофільні фракції лужної фосфатази використовували проби № 7-9, як гідрофобні фракцій ферменту - проби № 40-41.
2.4. Модифікація лужної фосфатази хлорангідридом адамантил-1-оцтової кислоти
Модифікація лужної фосфатази проводилась в зворотних міцелах аерозолю ОТ в октані взаємодією вільних аміногруп ферменту з хлорангідридом адамантил-1-оцтової кислоти за відомою методикою [70].
Хлорангідрид адамантил-1-оцтової кислоти було отримано нагріванням адамантил-1-оцтової кислоти (0,457 ммоль) з надлишком хлористого тіонілу (0,915 ммоль) при 80оС впродовж 45 хвилин, після чого хлористий тіоніл відганяли при зниженому тискові. Розчин лужної фосфатази (0,2 мл, концентрація 7,1·10-5 М) в боратному буфері (рН 9,18) солюбілізували в 10 мл 0,05 М розчину ди-(2-етилгексил)сульфосукцинату натрію (аерозолю ОТ) в октані. Систему інтенсивно струшували до досягнення оптичної прозорості і потім добавляли 0,1 мл 0,07 М розчину адамантил-1-ацетилхлориду в октані і витримували 5 хв, періодично перемішуючи. Модифікований фермент переосаджували ацетоном, центрифугували і відділяли від низькомолекулярних домішок на колонці з сефадексом G-10. Препарати лужної фосфатази для контрольної серії дослідів витримували в зворотних міцелах аерозолю ОТ, переосаджували ацетоном, а далі центрифугували і очищали на колонці з сефадексом G-10.
2.5. Визначення білка
Концентрацію білка визначали за оптичною густиною розчину при 280 нм. Для визначення білка за методом Бредфорда [104] до 1 мкл його розчину добавляли 2 мл розчину барвника (100 мг кумассі діамантового синього розчиняли в 50 мл 95%-ного етанолу, добавляли 100 мл 85%-ної фосфорної кислоти і розбавляли водою до 1 л). Через 20-30 хв вимірювали оптичну густину розчину при 595 нм (відносно чистого реагенту).
2.6. Дослідження кінетики впливу відновленого глутатіону на активність лужної фосфатази
Вплив відновленого глутатіону (L-глутаміл-L-цистеїнілгліцину) на швидкість гідролізу п-нітрофенілфосфату лужною фосфатазою з кишок теляти досліджували в 25 мМ трис-НСI буфері при рН 9. Використовували препарати ферменту без додаткового очищення, гідрофільні та гідрофобні фракції лужної фосфатази, отримані після її розділення на колонці з октилсефарозою, а також препарати лужної фосфатази, модифікованої хлорангідридом адамантил-1-оцтової кислоти. В зале