РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Матеріали
В роботі були використані такі реактиви та матеріали: лінолева кислота,
лінолевий спирт, Lubrol PX, Brij-99, ліпоксигеназа з сої («Sigma», США);
«Coomassie Brilliant Blue», додецилсульфат натрію («Fluka», Швейцарія);
етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА) («Reanal», Угорщина); 2-меркаптоетанол
(«Merck», Німеччина); тріс-(гідроксиметил)амінометан («Boehringer», Німеччина);
акріламід, N,N-метиленбісакріламід, N,N,N,N - тетраметилендіамід, персульфат
амонію, фосфатидилхолін, бромтимоловий синій («Serva», Німеччина);
Butyl-Sepharose CL-4B («Pharmacia», Швеція); бичачий альбумін з сироватки крові
(«Pierce», США); 4-гідрокси-2,2,6,6,-тетраметилпіперидинил-1-оксил,
2,2,6,6,-тетраметилпіперидинил-1-оксил («Aldrich», США); С18-картрідж (B&J,
Inc.), Sephadex G-25, DEAE-Toypearl (Toyo-Soda, Японія), фосфатидилінозит з
дріжджів, виробництва Харківського заводу бакпрепаратів.
1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилові естери гідрофобних кислот було
синтезовано та охарактеризовано в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії
НАН України к.х.н. Бабій Л. В. та Хільчевським О. М.
Реактиви вітчизняного виробництва мали кваліфікацію «Х.Ч.» або «ОС.Ч.». Для
виготовлення розчинів використовували бідистильовану воду.
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Отримання частково очищеного препарату 5-ліпоксигенази з бульб картоплі.
150 г очищених та подрібнених бульб картоплі сорту «Луговська» гомогенізували у
200 мл охолодженого Na-фосфатного буферного розчину (0,1 М, рН 6,0), що містив
1,27 мМ ЕДТА, 3,89 мМ аскорбінову кислоту, 2,93 мМ метабісульфіт натрію, та
екстрагували протягом 1,5 години при постійному повільному перемішуванні. В
буферний розчин для екстракції додавали Brij-99 до концентрації 0,02% від
загального об’єму. Суміш відфільтровували через чотири шари марлі і
центрифугували 40 хвилин (5000 об/хв, центрифуга РC-6). До надосадкової рідини
при постійному перемішуванні додавали дрібнодисперсний порошок сульфату амонію
до 25% від максимального насичення. Осад відокремлювали центрифугуванням
протягом 40 хв (5000 об/хв, центрифуга РC-6). Надосадкову рідину висолювали
сульфатом амонію до 50 % від максимального насичення і центрифугували 40 хв
(5000 об/хв., центрифуга РC-6) [101]. Отриманий осад розчиняли у мінімальному
об’ємі (30-40 мл) охолодженого Na-фосфатного буферного розчину (0,025 М, рН
6,3). Для видалення сульфату амонію використовували діаліз проти того ж
буферного розчину протягом 12 годин з однією зміною буфера, або гель-фільтрацію
на колонці заповненій Sephadex G-25 і врівноваженій Na-фосфатним буферним
розчином (0,0125 М, рН 6,3). Отриманий розчин білка пропускали через
С18-картридж.
Всі етапи виділення та очищення ферменту проводили при t=4єС. Отриманий
препарат ферменту зберігали при t=-17єС без помітної втрати активності протягом
0,5 року.
2.2.2. Отримання високоочищеного препарату 5-ліпоксигенази з бульб картоплі.
Виділення та перші стадії очищення 5-ЛО, а саме екстракцію та висолювання 25-50
% сульфатом амонію проводили як описано у розділі 2.2.1. Отриманий після 50 %
висолювання сульфатом амонію осад, розчиняли у мінімальному об’ємі (30-40 мл)
охолодженого тріс-HCl буферного розчину (0.0125 М, рН 7,5) і діалізували проти
того ж буферного розчину протягом 12 годин з однією зміною буферу.
Розчин білка після діалізу та центрифугування (центрифуга РС-6, 15 хв,
5000об/хв) наносили на колонку (2,5*15 см), заповнену DEAE-Toyopearl та
попередньо врівноважену тріс-HCl буферним розчином (0,025 М, рН 7,5), що містив
20 % гліцерин. Елюцію проводили лінійним градієнтом NaCl 0 - 0,25 М (V=150 мл)
в тому ж буферному розчині зі швидкістю 0,15 мл/хв.
Концентрацію білка визначали за поглинанням при 280 нм; контроль за активністю
ферменту проводили як описано у розділі 2.2.4. Ферментативну активність було
відмічено у двох піках (при 0,13 М та 0,17 М NaCl). Результати хроматографії
5-ЛО на DEAE-Toyopearl наведені на рис. 2.1. Фракції одного з піків, який мав
більшу питому активність (позначено пунктиром на рис. 2.1.) об’єднували,
додавали NaCl до кінцевої концентрації 0,5 М і наносили на колонку, заповнену
Butyl-Sepharose (1*10 см) та попередньо врівноважену тріс-HCl буферним розчином
(0,025 М, рН 7,5), який містив 0,5 М NaCl та 20 % гліцерин. Елюцію проводили
буферним розчином того ж складу зі швидкістю 0,15 мл/хв. Після виходу з колонки
першого піку ліпоксигеназної активності, елюцію продовжували тим же буферним
розчином. За перебігом хроматографії спостерігали, контролюючи концентрацію
білка та активність ферменту. В результаті хроматографії було отримано дві
фракції ферменту, що суттєво різняться за спорідненістю до гідрофобного носія
та питомою активністю (рис. 2.2.). Фракції з найбільшою питомою активністю
(область, обмежена пунктирною лінією на рис. 2.2.) об’єднували і
використовували для наступних досліджень. Всі етапи очищення проводили при
температурі 4єС.
Рис. 2.1. Хроматограма 5-ліпоксигенази з бульб картоплі на DEAE-Toyopearl (рН
7,5).
(^) – активність 5-ліпоксигенази;
(?) - оптичне поглинання при 280 нм;
крива без символів позначає градієнт NaCl; область обмежена пунктиром позначає
фракції, які було використано на наступних етапах очищення
Рис. 2.2. Хроматограма 5-ліпоксигенази з бульб картоплі на Butyl-Sepharose (рН
7,5).
(^) – активність 5-ліпоксигенази;
(?) - концентрація білка;
крива без символів позначає градієнт NaCl. Область обмежена пунктиром позначає
фракції, які було використано в наступних дослідженнях
На кожному етапі очищення визначали концентрацію білка за Бредфордом [121] та
активність фе