РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Під нашим спостереженням перебувало 102 хворих на ХЧВ віком від 17 до 74 років, з них 51 особа чоловічої і 51 - жіночої статі, які знаходилися з 2000 по 2003 рр. на диспансерному обліку в Харківському обласному шкірно-венерологічному диспансері, Інституті дерматології та венерології АМН України, стаціонарних шкірно-венерологічних відділеннях 27-ї та 31-ї клінічних лікарень м. Харкова.
У процесі динамічного спостереження за хворими ретельно аналізувалися дані анамнезу, клінічного перебігу хвороби, результати огляду стану шкіри й видимих слизових оболонок, периферичних лімфатичних вузлів, обстеження стану внутрішніх органів і систем організму (серцево-судинної, дихальної, травної, ендокринної, сечостатевої, опорно-рухової, органу зору тощо). Усі хворі були консультовані суміжними спеціалістами: терапевтом, ревматологом, невропатологом, ендокринологом, гінекологом, офтальмологом та ін.
Хворі при встановленні діагнозу й наступному спостереженні підлягали клініко-лабораторному обстеженню, яке вміщувало: клінічні аналізи крові та сечі, дослідження мазка крові на LE-клітини, пробу за Зимницьким, вивчення показників білкового (загальний білок і фракції, С-реактивний білок, сіалові кислоти, серомукоїд) та вуглеводного обмінів (цукор крові), функціонального стану печінки (тимолова проба, проба Вельтмана), печінкові трансамінази, лужну фосфатазу, креатинфосфокіназу, коагулограми (протромбіновий індекс, час рекальцифікації, час утворення фібрину, кількість фібрину, фібриногену, толерантність плазми до гепарину). Біохімічні показники в процесі спостереження визначали за уніфікованими методами [56, 131]. Проводилося також серологічне дослідження крові на сифіліс, наявність австралійського антигену. У більшості хворих проведено вивчення показників ЕКГ, УЗД печінки та нирок, у деяких - дуплексне сканування судин нижніх кінцівок.
Хворих на ХЧВ розподілено на дві групи залежно від статево-вікових особливостей: 1 група - чоловіки віком 19-44 років і жінки віком 17-45 років (репродуктивний вік); 2 група - чоловіки у віці від 45 до 74 років та жінки у віці 48-74 років (клімактеричний і постклімактеричний вік). Контрольні групи склали 40 практично здорових осіб, з них 20 чоловіків (10 чоловіків віком 25-41 року, 10 чоловіків 48-56 років) і 20 жінок (10 жінок віком 25-42 років, 10 жінок від 48 до 55 років).
З метою визначення В-клітинної активації у 102 хворих на різні форми ХЧВ (51 чоловіка віком 19-74 років і 51 жінки у віці 17-74 років) у динаміці спостереження вивчали стан гуморальної ланки імунітету за рівнем CD19+-клітин, аДНК, аКЛ, ЦІК, імуноглобулінів основних класів - G, М, А. Забір крові з ліктьової вени здійснювали в ранкові години (8-8.30 год) натще в стерильні гепаринізовані флакони кількістю 10 мл і в стерильні пробірки кількістю 5 мл. Сироватки, в яких досліджувалися аДНК і аКЛ, зберігалися при температурі -20оС не більше 3 місяців.
Кількість В-лімфоцитів (СD19+-клітин) периферичної крові визначали методом непрямої поверхневої мембранної імунофлюоресценції за допомогою моноклональних антитіл або CD-маркерів виробництва Російського онкоценру "Клоноспектр" (м.Москва) [141]. Визначення рівня ЦІК у сироватці периферичної крові проводили спектрофотометричним методом [87], що ґрунтується на зміні величини світлового розсіювання внаслідок преципітації комплексів антиген-антитіло в 3,5 % розчині поліетиленгліколю. Концентрацію імуноглобулінів в сироватці крові досліджували методом радіальної імунодифузії з використанням моноспецифічних сироваток проти імуноглобулінів людини виробництва НДІ епідеміології та мікробіології (Нижній Новгород, Росія); рівень аДНК та аКЛ у сироватці крові імуноферментним методом з використанням стандартних тест-систем фірми "Human" (Германія), кардіоліпіну ("Sigma", США) [92].
У лунки полістиролових мікроплат вносили по 0,05 мл кардіоліпіну в спирті ("Sigma") в кінцевій концентрації 50 мкг/мл та інкубували при 4оС протягом 18 год. Потім лунки з іммобілізованим на твердій фазі кардіоліпіном відмивали тричі 200 мкл 0,15М PBS. Для блокування неспецифічного зв'язування і в якості антитіл до аФЛ-кофактора (?2-GPI) в лунки вносили по 100 мкл 10 % FCS в PBS та інкубували протягом 1 год при кімнатній температурі. Лунки мікроплат промивали 3 рази PBS і в кожну лунку додавали по 50 мкл досліджуваної сироватки в розведенні 1:50 в 10 % розчині FCS в PBS та інкубували 3 години при кімнатній температурі. Потім лунки промивали 5 разів PBS для видалення антитіл, які не зв'язалися, і вносили по 50 мкл кролячих антитіл до Ig G та Ig M людини, мічених пероксидазою хрону ("Sigma", США), інкубували протягом 90 хвилин при кімнатній температурі. Непов'язаний кон'югат відмивали 5 разів PBS, після чого до лунок додавали субстратний розчин (ОФД з перекисом водню). Після зупинки реакції вимірювали оптичну щільність на багатоканальному фотометрі при довжині хвилі 492 нм. При врахуванні результатів реакції із середніх арифметичних значень оптичної щільності позитивного стандарту, негативного контролю та сироваток, які тестувалися, віднімали середнє арифметичне значення оптичної щільності 10 % розчину FCS в PBS. Концентрацію Ig G- та Ig M-аКЛ виражали в міжнародних стандартних одиницях GPL і MPL. При цьому 1 од. GPL відповідала кардіоліпінпов'язуючій активності 1 мкг/мл IgG-аКЛ, а 1 од. MPL - 1 мкг/мл IgM-аКЛ, виділених за допомогою афінної хроматографії. Застосовували калібровочну криву залежності логарифму оптичної щільності стандарту від логарифму концентрації аКЛ.
Позитивними вважали показники, які перевищували середні рівні (М) плюс 5 стандартних відхилень (?), виміряні у осіб контрольної групи (7,25±3,49 GPL у чоловіків і 7,80±3,29 GPL у жінок; 3,90±2,35 MPL у чоловіків і 4,15±2,25 MPL у жінок). Для IgG-аКЛ цей рівень склав 26 GPL, для IgM-аКЛ - 17 MPL. Позитивні результати визначення аКЛ у хворих підтверджували дворазовим тестуванням антитіл.
Згідно міжнародним рекомендаціям при інтерпретації результатів вико