РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконана в Тернопільській дослідній станції Інституту ветеринарної
медицини УААН в період 2001 – 2004рр.
Основними напрямками дослідження було вдосконалення ветеринарно-санітарного
контролю молока щодо вмісту золотистого стафілококу, визначення відповідності
його міжнародним нормам, згідно Директиви Ради ЄС 92/46 (1992) щодо одержання
молока гарантованої безпеки.
Комплексна робота включала визначення основних джерел надходження золотистого
стафілококу в молоко у процесі доїння корів та первинної обробки молока, їх
питоме значення в цьому процесі, а також при охолодженні за різних температур і
доставці на молокопереробний завод. Схема проведених досліджень за темою
дисертації наведена на рис. 2.1.
Як видно із схеми, робота складається із основних чотирьох блоків досліджень.
Перший блок охоплював комплекс моніторингових досліджень на наявність
золотистого стафілококу таких об’єктів: асептично надоєне молоко здорових і
хворих на мастит корів, шкіра дійок вимені корів за різного стану їх здоров’я,
молочне обладнання за різного санітарного стану, предмети середовища
корівників.
Другий блок – вивчення основних властивостей плазмокоагулюючих стафілококів,
виділених від корів і з предметів середовища корівників. Удосконалення
лабораторних методів досліджень стафілококів складало зміст третього блоку.
Виконання програми трьох блоків схеми досліджень дало можливість визначити
норматив безпеки молока сирого за вмістом золотистого стафілококу, розробити
методику визначення цього нормативу, виявити основні критичні точки контролю
молока в ланцюгу „вим’я корів – переробне підприємство”.
Отже, робота дістала логічне завершення щодо розробки рекомендацій з
ветеринарно-санітарного контролю безпеки молока сирого за вмістом золотистого
стафілококу.
Відбір зразків молока, секрету з молочної залози, змиви з шкіри і слизових
оболонок, з молочного обладнання і посуду, з об’єктів довкілля ферми, доставку
їх у лабораторію проводили згідно методичних рекомендацій [82, 83, 84],
мікробіологічний аналіз проводили, керуючись ГОСТ 9225-84 [31], ГОСТ 303417-97
[97] і ДСТУ 3662-97 [45].
При дослідженні стафілококів керувалися такою схемою:
1. виділення і визначення належності кокових культур до родини Mіcrococcaceae,
шляхом проведення мікроскопії і визначення каталазної активності
(загальновизнаним методом);
2. належність каталазопозитивних кокових культур до роду Staphylococcus
визначали за здатністю ферментувати глюкозу [163]. Культури, які ферментували
глюкозу, підлягали подальшому дослідженню;
3. визначення здатності культур стафілококів до плазмокоагуляції проводили
звичайним методом із використанням цитратної плазми крові кролика, великої
рогатої худоби, коня.
Властивість ферментувати маніт визначали в середовищі типу Хью-Лейфзона. Для
визначення типу стафілококових гемолізинів використовували метод Ілек-Леві
[153], Маркс-Вейгана [173].
Фосфатазу визначали за методом, який описаний А. К. Акатовим і Т.М. Самсоновою
[4]. Фенолфталеїнфосфат натрію добавляли до поживного агару в концентрації
0,01% і розливали в чашки Петрі. Культури стафілококів сіяли бляшками по 16
культур на одну чашку. Інкубували протягом 18-24 годин при температурі 37° С.
При обліку результатів на кришку чашки Петрі наносили п’ять крапель 25%-ного
розчину аміаку і закривали дном чашки Пері з посівом. Витримували в парі аміаку
протягом п’яти хвилин. Позитивним результат вважали тоді, коли колонії культур
стафілококів набували рожевого забарвлення, негативним – білого кольору.
Визначення дезоксирибонуклеазної (ДНК-азної) активності стафілококів проводили
згідно методичних рекомендацій [83, 165].
Здатність стафілококів до продукування лецитинази визначали на середовищі
Чистовича в оригінальному методі [57]. Для цього до 100 см3 м‘ясопептонного
бульйону додавали 10% хлористого натрію і 20% агару, встановлювали рН 7,2 –
7,4, середовище стерилізували при 120єС протягом 20 хв. Перед використанням
агар розплавляли, охолоджували до 45-50єС і додавали 20% (по об’єму)
стерильного жовтка курячого яйця (один жовток курячого яйця на 100-150 см3
стерильного фізіологічного розчину). Середовище швидко перемішували і розливали
в чашки Петрі по 15-20 см3, підсушували протягом 30 хвилин при 37єС у
термостаті. Інкубацію посівів проводили при 37єС протягом 48 годин. Позитивним
результат вважався у випадку появи навколо колоній стафілококів зони
просвітління у вигляді райдужного вінчика.
Колір колоній стафілококів на м’ясопептонному агарі з кристалічним фіолетовим
визначали за Меєром [171]. До 100 см3 м‘ясопептоного агару додавали 1%-ий
свіжоприготовлений розчин кристалічного фіолетового із розрахунку кінцевого
його вмісту в середовищі 1 : 100000. Посів культур проводили бляшками по 16 на
одній чашці, інкубацію проводили при 37°С протягом 24 години, і потім визначали
колір макроколонії.
Продукування нітратредуктази визначали у м‘ясопептонному бульйоні з 0,1%-ним
розчином азотнокислого калію. Середовище розливали в пробірки по 3-5 см3,
стерилізували при 0,5 атм. протягом 30 хвилин. Добові культури висівали в
пробірки і вирощували при температурі 37°С протягом 24 годин. Потім у кожну
пробірку вносили декілька крапель реактиву Грісса. В присутності нітратів,
появляється червоне або рожеве забарвлення.
Утворення ацетилметилкарбінолу (ацетоїну) з глюкози (реакція Фогес-Проскауера),
визначали так: культуру стафілококу (одну бактеріологічну петлю) висівали в
середовище Кларка і вирощували протягом п’яти діб при температурі 37°С. Потім
до 5 см3 культури дода