Ви є тут

Розробка інструментальних аналітичних біотестів та вивчення їхніх основних характеристик при визначенні токсичності об'єктів довкілля

Автор: 
Левковець Інна Андріївна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2005
Артикул:
0405U001345
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Використані реактиви та інші матеріали
В ході виконання дисертаційної роботи використано такі реактиви:
- трис (“Sigma”),
- люмінол (“Sigma”),
- п-йодфенол (“Sigma”),
- EDTA – етилендиамін тетраоцтової кислоти (“Sigma”),
- метоміл (“Sigma”),
- тритон Х-100 – оксиетильований октилфенол (“Sigma”),
- твін-20 – оксиетильований ефір ангідросорбіту та жирних кислот (“Merck”),
- твін-80 (“Sigma”),
- ОП-10 – оксиетильований нонілфенол, (вітчизняного виробництва, х.ч.),
- етоній – {1,2[N,N-біс(диметил) – N,N-бісдециацетат)] етилендиамоній
дихлорид}, (вітчизняного виробництва, х.ч.),
- g-амінопропілтриетоксисилан (АПТС), (“Fluka”),
- білок теплового шоку (БТШ 70) з мозку бика (“Sigma”),
- моноклональні анти-БТШ 70 з мишей (“Sigma”),
- бичачий сироватковий альбумін (БСА) (“Sigma”),
- поліклональні антитіла проти БСА з кролів (“CFRI”),
- трифлюралін (Vegyimыvek Rt., Угорщина),
- поліклональні антитіла проти трифлюраліну з кролів (PPI-HAS),
- глутаровий альдегід (ГА) (“Sigma”),
- сукциновий ангідрид (“Sigma”),
- N-гідроксисукцинімід (N-ГС) (“Sigma”),
- 1-етил-3-(3-диметиламінопропіл)карбодиімід (EДК) (“Sigma”),
Інші реактиви - CaCl2 · 6 H2O, MgSO4 · 7 H2O, NaHCO3, KCl, K2Cr2O7 - мали
аналітичну марку.
2.2. Методика біотестування з використанням Daphnia magna Straus
В дослідах використовували рачки Daphnia magna Straus (Cladocera, Daphnia), що
мешкали в умовах, встановлених міжнародним та українським стандартами [45,
75].
В експеримент відбирали дафній віком не більше 24 годин (ювенісів), яких в
кількості 1 – 5 особин вміщували в склянки з 10 мл культурального середовища та
інкубували їх в термостаті при 28°С протягом 30 хв – 24 годин (в залежності від
мети експерименту). У дослідах і контролі проводили по три паралельних
визначення.
Спонтанну ХЛ інкубаційного середовища дафній реєстрували при додаванні 50 мкл
0,2 мМ розчину люмінолу в 50 мМ трис-буфері (рН 8,5) до 500 мкл середовища,
збуджену ХЛ – при додаванні по 50 мкл 0,2 мМ люмінолу та 1% розчину пероксиду
водню до 500 мкл середовища. Для підсилення активованої ХЛ в 500 мкл середовища
поступово вносили по 50 мкл люмінолу, п-йодфенолу та 1% пероксиду водню.
З метою одержання та обробки інформації щодо інтенсивності ХЛ середовища
інкубування дафній використовували хемілюмінометер ХМЛ-3, що включав: блок
підсилення сигналу на базі ФЕП-176; блок подачі хімічних реагентів до
досліджуваних зразків; блок управління, де застосовується цифрове
мікропроцесорне оброблення сигналів, що дозволяє максимально автоматизувати
процес. Для реєстрації сигналів використовували персональний комп’ютер, який
підлючали до ФЕП через інтерфейс.
2.3. Методика біотестування з використанням біолюмінесцентних бактерій
В дослідженнях використовували наступні штами біолюмінесцентних бактерій:
Photobacterium.phosphoreum K3 (IMB B-7071), Vibrio fischeri F1 (IMB B-7070),
Vibrio fischeri Sh1, виділених із Чорного та Азовського морей в 1998 – 2001 рр
та відібраних за максимальною чутливістю до ПАР та іншим токсичним речовинам
серед 20 інших штамів люмінесцентних бактерій [116, 117]. Біолюмінесцентні
бактерії культивували протягом 16 – 18 годин в колбах при постійному
перемішуванні при температурі 18 – 20°С на середовищі наступного складу: пептон
– 5 г/л; екстракт дріжджів – 5 г/л; 0,51 М NaCl; 0,05 М K2HPO4Ч7H2O; 4 мМ
(NH4)2HPO4; 0,4 мМ MgSO4Ч7H2O; 2 мМ CaCO3, гліцерол – 3 мг/л. Для аналізу
токсичності ПАР в кюветі люмінометру БЛМ-8801 (СКТБ «Наука», Росія) змішували
0,8 мл розчину ПАР в 2,5% розчині NaCl, 100 мкл 0,5 М фосфатного (рН 7,0) або
фосфатно-цитратного буферного розчину (рН 5,5), а також 200 мкл бактеріальної
суспензії, яка містила 5·105 клітин/мл. Реєстрували зміну інтенсивності (I) БЛ
протягом 30 – 120 хв при різних концентраціях ПАР. Рівень токсичності виражали
у вигляді концентрації ПАР, що викликає 50% зниження інтенсивності БЛ суспензії
біолюмінесцентних бактерій – ЕК50 (ефективна концентрація) [118]. Рівень БЛ
бактерій в 2,5% розчині NaCl в присутності відповідного буферного розчину
приймали за 100%.
2.4. Головні елементи конструкції імуносенсору на основі OWLS та характеристика
показників його роботи
Датчик (рис. 2.4.1) складається із оптичного шару хвильоводу (A), розташованого
на поверхні скляної підкладки (Б) та оптичної решітки, зробленої у хвильоводі.
Коли поляризоване лазерне проміння (В) (He-Ne) досягає решітки, відбувається
його дифракція. Кут дифракції (Г) залежить не тільки від оптичних параметрів
сенсора, а і від рефрактивного індексу покриття поверхні. Хвильовід поступово
обертається (Г), і коли дифрагований промінь потрапляє у хвильовід, він
розповсюджується до краю датчика через багатократне внутрішнє відбиття.
Інтенсивність відбитого світла реєструється фотодіодами (Д).
Рис. 2.4.1. Схема датчика імуносенсора на основі OWLS.
Чип складається з двох шарів, що мають різну оптичну густину. Перший шар – це
скляна підкладка товщиною 0,5 мм та другий шар – це шар хвильоводу товщиною 160
– 220 нм. На поверхні хвильоводу розташована дифракційна решітка з
періодичністю 2400 ліній на мм.
На рисунку 2.4.2 представлено схематичне зображення приладу OWLS 100, що
конролюється програмою Biosense (обидва виробництва MicroVacuum Ltd, Угорщина).
Оскільки біологічні процеси, що досліджуються, відбуваються у рідкій фазі,
потік розчину через комірку спрямовано в області решітки хвильоводу. Детектор
приладу з’єднаний з проточною інжекторною системою, яка містить перистальтичну
помпу, що забезпечує потік буферного розчину зі швидкістю 90 мкл/хв, та
інжектор, об’єм петлі якого становить 200 мкл.
Рис. 2.4.2. Схематичне зображення приладу.
Чип розташовує