РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали дослідження
Експериментальну частину роботи було проведено на щурах лінії Wistar, 4
місячного віку (98 самців). Тварини знаходилися
в стандартних умовах із циклічністю доби: світло - 12 годин, ніч - 12 годин.
Для досліджень використовували мозок та сироватку крові щурів. Декапітацію
тварин проводили під швидким ефірним наркозом.
Дослідження були проведені з використанням хімічно чистих реагентів фірм Sigma
(США), Serva (США), Fluka (Швейцарія), ANAWA (Німеччина), Ranbaxy (Індія),
Medix Biochemica (Фінляндія), Boehringer (Німеччина), Реагент (Дніпропетровськ,
Україна).
2.2. Експериментальна модель післяопераційного болю
Експериментальна модель соматогенного післяопераційного болю була створена за
модифікацією моделі Бреннана та співавторів [160].
Детальніше, на плантарній частині задньої правої кінцівки щура, анестезованого
ефіром, після обробки шкіри розчином йоду та пеніциліну, проводився розтин
шкіри, фасції та м’язів довжиною 10 мм за допомогою леза SM65. Розтин починали
за 5 мм від проксимального боку п’яти
і продовжували у напрямку кінцівок. Після легкого натискання на рану зупиняли
кровотечу та накладали 2 шовкових шви нейлоновими нитками
3 номеру та голкою FS2. Рану повторно обробляли йодом та сумішшю поліміксину В
та неоміцину. Після операції тварин повертали до кліток. Експерименти проводили
у відповідності до етичних принципів експериментальних досліджень на тваринах
[161].
З метою створення фармакологічного впливу на інтенсивність післяопераційного
болю використовували глутамат (агоніст НМДА рецепторів), МК-801 (неконкурентний
інгібітор НМДА рецепторів) та не стероїдний протизапальний препарат Кетанов
(Ranbaxy, Індія). Усі препарати були введенні інтраперитонеально.
Щурі були розділені на 8 груп, по 7 тварин у кожній групі: 1 – інтактні щурі; 2
– оперовані; 3 – введення глутамату 1 мг/кг маси тіла, без операції;
4 - введення глутамату за 5 хв. до операції; 5 – введення МК-801
0,5 мг/кг маси тіла, без операції; 6 – введення МК-801 за 5 хв. до операції; 7
– введення препарату Кетанов 0,5 мг/кг маси тіла, без операції; 8 – введення
Кетанов за 5 хв. до операції.
Декапітацію тварин проводили через 24 години після операції, на час
найгострішої гіпералгезії, та наприкінці сьомої доби, на час зниження
гіпералгезії та загоювання рани. Для подальших досліджень використовували мозок
та сироватку крові тварин.
2.3. Приготування сироватки крові
Венозну кров збирали у скляні пробірки, відстоювали протягом 2 годин при
кімнатній температурі й центрифугували 15 хв. при 1000 об/хв. Сироватку крові
відбирали у пластикові пробірки та використовували
для подальшого аналізу.
2.4. Тестування у відкритому полі
Дослідження фізіологічної активності щурів проводили за допомогою тестування у
відкритому полі за Бурешом [162]. Поведінка тварин визначалася безпосередньо
дослідним спостерігачем, який сидів тихо, недалеко від відкритого поля,
використовуючи комп’ютеризований запис подій. Відкрите поле обробляли 70%
розчином етанолу після кожної тварини, для запобігання впливу відволікаючих
факторів під час тестування. Всі тести проводили протягом однієї й тієї ж фази
світлового циклу.
Для формування груп ми брали щурів зі схожою поведінковою активністю,
виключаючи занадто активних та пасивних тварин.
Підлога відкритого поля (80ґ80 см) виготовлена з фанери, пофарбована у білий
колір та поділена на 16 квадратів (20ґ20 см) чорними лініями. Центральний
квадрат сформований з чотирьох внутрішніх квадратів. На полі є 9 нірок (d=4см)
на перетині ліній чотирьох внутрішніх квадратів.
Підлога відкритого поля знаходиться на ніжках 50 см заввишки.
Щура розміщували у кутку орієнтуючи до центру і дозволяли рухатись по
апаратному полю протягом 5 хв. У ході поведінкового тестування визначали:
кількість ліній які перетнула тварина, кількість відвідувань центральних
квадратів, вертикальні стійки, зазирання у нірки, дефекацію, грумінг.
Тестування у відкритому полі дозволяє одночасно дослідити локомоторну,
дослідницьку активність та емоційний стан тварин [162].
2.5. Отримання білкових фракцій мозку
Мозок щурів очищали від поверхневої плівки та капілярів, вилучали окремо
довгастий мозок та таламус/гіпоталамус. Усі операції з мозком проводили при
температурі +4° С.
Гомогенізацію тканини мозку проводили в буфері А, що містив
трис-НCl – 25 мМ; рН 7,4; ЕДТО – 1 мМ; в-меркаптоетанол – 2 мМ;
ФМСФ – 0,2 мМ; мертіолят – 0,01%, у співвідношенні 1:10. У ході послідовних
стадій центрифугування були видалені фракції, що містять розчинні й мембранні
білки (інкубація гомогенату в буфері А, що додатково містив тритон Х-100 – 2%).
Після цього осад ресуспендували в розчині буферу А, у склад якого додавали
сечовину – 4 М, екстракція проходила протягом 18 год. Подальше центрифугування
проводили при 100 000 g протягом 60 хв., супернатант містив сечовиннорозчинні
філаментні білки. Отримані фракції використовували для визначення кількості
нервово специфічних білків.
2.6. Визначення загальної кількості білку
Кількість загального білка визначали за методом Бредфорд [163].
Для побудови калібрувальних кривих за стандарт використовували розчини бичачого
сироваткового альбуміну. Метод кількісного визначення білка
за допомогою кумасі діамантового блакитного G-250 базується
на перетворенні помаранчевого кольору барвника в блакитний при зв’язуванні з
білком, при цьому максимум поглинання зміщується відповідно з 465 на 595 нм. В
цьому випадку концентрація зв’язаного барвника прямо пропорційна концентрації
білка в пробі. У слабких розчинах кумасі діамантовий блакитний G-250 має два
негативних заряди, тому легко зв’язує основні амін
- Київ+380960830922