Взаємозв'язок між активністю оксидантного стресу, атерогенністю плазми та функціональним станом судинної стінки при системному запальному синдромі

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження були проведені на 52 дорослих кролях породи “шин­шила” масою
3,0-3,5 кг. Експери­ментальні тварини були поділені на 3 групи.
1 група включала 12 нормальних кролів, які утримувалися на стандарт­ному
харчовому раціоні.
2 група включала 20 кролів, які утримувались на стандартній дієті і на яких
від­творювали системний запальний процес шляхом внутрішньовенного введення
пі­рогеналу (НДІ ім. акад. М.Ф.Гамалєя РАМН, Росія). Пірогенал являє собою ЛПС,
виділений з клітин грамнегативних бактерій (Salmonella typhy та ін.). Введення
пірогеналу здійснювали за оригінальною запатентованою схемою: по 3 мінімальні
пірогенні дози (МПД) на 1 кг маси кроля 3 рази на тиждень протягом першого
тижня, з наступним введенням по 3 МПД/кг маси кроля 1 раз на тиждень протягом
семи тижнів проведення експерименту [24]. Для відтворення системного
запаль­ного процесу використовувався піроге­нал в дозі, що викликала підвищення
темпе­ра­тури у кролів на 1,50С.
3 група включала 20 кролів з відтвореною моделлю системного запального процесу,
яким застосовували фенофібрат (Ліпантіл 200 М – Laboratorіes FOURNIER S.C.A.,
Франція) по 9 мг/кг маси кроля на добу протягом 8 тижнів.
У всіх тварин у вихідному стані, через 2, 4, 6 та 8 тижнів після першого
вве­ден­­ня пірогеналу проводили визначення показників, які характеризували
інтенсив­ність сис­темного запального процесу, вираженість оксидантного стресу
та по­ру­шення ліпід­ного обміну. Поряд з цим через 8 тижнів експерименту
досліджували реактивність судинних сегментів аорти нормальних кролів, а також
кролів з експериментальною мо­деллю системного запального процесу та кролів, у
яких відтворення системного запалення супровод­жу­валось застосуванням
фенофібрату.
Всі експерименти виконувалися з дотриманням вимог Страсбурзької Конвенції щодо
використання хребетних тварин в експерименті.
2.1. Визначення інтенсивності системного запального процесу.
Показники інтенсивності системного запалення визначали у венозній кро­ві, забір
якої здійснювали із вушної вени в кількості 15 мл силіконізованою гол­кою в
пластикові або силіконізовані скляні пробірки з розчином гепарину (100 МО/мл),
який використовували в якості антикоагулянта. Після цен­трифугування крові при
5000 об/хв протягом 20 хв відбирали плазму, яку стери­лізували філь­тра­цією
(діаметр пор 0,22 мкм).
Визначення концентрації С-реактивного протеїну (СРП) в плазмі проводи­ли
імунотурбіметричним методом, який полягає в тому, що СРП утворює іму­нний
ком­плекс із специфічною антисироваткою, результатом чого є збіль­шення
оптичної щіль­ності розчину. Збільшення абсорбції після додавання антисироватки
при довжині хвилі 340 нм пропорційне концентрації СРП, що визначали на
напівавтоматичному біохімічному аналізаторі “Cormay plus” (Поль­ща) із
застосуванням наборів фірми “Cormay” (Польща).
Показником активації моноцитів був внутрішньоклітинний вміст малонового
діальдегіду (МДА), який є кінцевим продуктом пероксидації вільних жирних
кис­лот, що входять до складу фосфоліпідів клітинних мембран. Для одержання
суспен­зії моноцитів використовували метод H.Recalde [139]. Забір крові та
відбір плазми здійснювали за вищеописаним способом. Після цього відби­ра­ли
лейкоконцентрат, який знаходився на поверхні еритроцитарної маси. Для
ви­далення тромбоцитів лейкоконцентрат двічі промивали 6-8 об’ємами
фосфатно-со­льового буфера, що містив 0,4 мг/мл динатрієвої солі ЄДТА,
центрифугуючи щоразу при 1000 об/хв протягом 5 хв. Відносно чисті суспензії
моноцитів (90% чистоти) одержували шляхом флотації в градієнті (1,077-1,078)
“фікол (Serva, USA) – верографін (Serva, USA)”. Фікол-ве­р­о­­графіновий розчин
готували шляхом розчинення 9 г фіколу (Serva, USA ) в 100 мл дистильованої
води. Густину розчину доводили верографіном (Serva, USA) до 1,077-1,078. Після
центрифугування при 2000 об/хв протягом 30 хв відбирали “кільце” моноцитів, що
утворилося на межі фікол-плазма, та ресуспендували його в 0,9% розчині хлориду
натрію.
Метод визначення МДА в моноцитах полягає у визначенні кількості ТБК-активних
продуктів в досліджуваних пробах [12]. В основу тіобарбітурового ме­тоду
покладено визначення концентрації забарвленого комплексу, що утворюється
внаслідок реакції малонового діальдегіда (МДА) з двома молекулами
тіобарбітурової кислоти (ТБК) в кислому середовищі при температурі 90-1000С.
Максимум світлопоглинання утвореного комплексу знаходиться в області 532 нм. За
допомогою даного методу визначається МДА, присутній в біологічному субстраті та
МДА, що утворюється безпосередньо під час аналізу при нагріван­ні проби в
кислому середовищі. До 0,1 мл суспензії моноцитів додавали 0,1 мл розчину
хлориду заліза (270мг FeCl3?6Н2О в 100 мл дистильованої води), 1,5мл
гліцинового буферу (0,2 моль/л, рН=3,6), 1,5 мл розчину ТБК (50 мг ТБК на 10 мл
дистильованої води та 30 мг додецилсульфату, нагрівати до розчинення), 0,1 мл
бутилокситолуолу. Суміш витримували протягом 15 хвилин на водяній бані при
температурі 90-1000С, охолоджували до кімнатної температури, після чого
додавали 1мл крижаної оцтової кислоти та 1мл хлороформу. Одержану суміш
струшували, після чого центрифугували при 2000 об/хв протягом 5 хвилин.
Кількість продуктів реакції визначали за оптичною щільністю на
спект­ро­фотометрі СФ-46 при довжині хвилі 532 нм в кюветі з товщиною оптичного
шару 1 см.
Для проведення розрахунків використовували формулу:
Д
С = ----------- ,
Е
де Д – оптична густина біологічного матеріалу;
Е – коефіцієнт екстінкції, що дорівнює 1,56.105 (М-1Чсм-1)
Кількість