РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження були проведені на 52 дорослих кролях породи “шиншила” масою
3,0-3,5 кг. Експериментальні тварини були поділені на 3 групи.
1 група включала 12 нормальних кролів, які утримувалися на стандартному
харчовому раціоні.
2 група включала 20 кролів, які утримувались на стандартній дієті і на яких
відтворювали системний запальний процес шляхом внутрішньовенного введення
пірогеналу (НДІ ім. акад. М.Ф.Гамалєя РАМН, Росія). Пірогенал являє собою ЛПС,
виділений з клітин грамнегативних бактерій (Salmonella typhy та ін.). Введення
пірогеналу здійснювали за оригінальною запатентованою схемою: по 3 мінімальні
пірогенні дози (МПД) на 1 кг маси кроля 3 рази на тиждень протягом першого
тижня, з наступним введенням по 3 МПД/кг маси кроля 1 раз на тиждень протягом
семи тижнів проведення експерименту [24]. Для відтворення системного
запального процесу використовувався пірогенал в дозі, що викликала підвищення
температури у кролів на 1,50С.
3 група включала 20 кролів з відтвореною моделлю системного запального процесу,
яким застосовували фенофібрат (Ліпантіл 200 М – Laboratorіes FOURNIER S.C.A.,
Франція) по 9 мг/кг маси кроля на добу протягом 8 тижнів.
У всіх тварин у вихідному стані, через 2, 4, 6 та 8 тижнів після першого
введення пірогеналу проводили визначення показників, які характеризували
інтенсивність системного запального процесу, вираженість оксидантного стресу
та порушення ліпідного обміну. Поряд з цим через 8 тижнів експерименту
досліджували реактивність судинних сегментів аорти нормальних кролів, а також
кролів з експериментальною моделлю системного запального процесу та кролів, у
яких відтворення системного запалення супроводжувалось застосуванням
фенофібрату.
Всі експерименти виконувалися з дотриманням вимог Страсбурзької Конвенції щодо
використання хребетних тварин в експерименті.
2.1. Визначення інтенсивності системного запального процесу.
Показники інтенсивності системного запалення визначали у венозній крові, забір
якої здійснювали із вушної вени в кількості 15 мл силіконізованою голкою в
пластикові або силіконізовані скляні пробірки з розчином гепарину (100 МО/мл),
який використовували в якості антикоагулянта. Після центрифугування крові при
5000 об/хв протягом 20 хв відбирали плазму, яку стерилізували фільтрацією
(діаметр пор 0,22 мкм).
Визначення концентрації С-реактивного протеїну (СРП) в плазмі проводили
імунотурбіметричним методом, який полягає в тому, що СРП утворює імунний
комплекс із специфічною антисироваткою, результатом чого є збільшення
оптичної щільності розчину. Збільшення абсорбції після додавання антисироватки
при довжині хвилі 340 нм пропорційне концентрації СРП, що визначали на
напівавтоматичному біохімічному аналізаторі “Cormay plus” (Польща) із
застосуванням наборів фірми “Cormay” (Польща).
Показником активації моноцитів був внутрішньоклітинний вміст малонового
діальдегіду (МДА), який є кінцевим продуктом пероксидації вільних жирних
кислот, що входять до складу фосфоліпідів клітинних мембран. Для одержання
суспензії моноцитів використовували метод H.Recalde [139]. Забір крові та
відбір плазми здійснювали за вищеописаним способом. Після цього відбирали
лейкоконцентрат, який знаходився на поверхні еритроцитарної маси. Для
видалення тромбоцитів лейкоконцентрат двічі промивали 6-8 об’ємами
фосфатно-сольового буфера, що містив 0,4 мг/мл динатрієвої солі ЄДТА,
центрифугуючи щоразу при 1000 об/хв протягом 5 хв. Відносно чисті суспензії
моноцитів (90% чистоти) одержували шляхом флотації в градієнті (1,077-1,078)
“фікол (Serva, USA) – верографін (Serva, USA)”. Фікол-верографіновий розчин
готували шляхом розчинення 9 г фіколу (Serva, USA ) в 100 мл дистильованої
води. Густину розчину доводили верографіном (Serva, USA) до 1,077-1,078. Після
центрифугування при 2000 об/хв протягом 30 хв відбирали “кільце” моноцитів, що
утворилося на межі фікол-плазма, та ресуспендували його в 0,9% розчині хлориду
натрію.
Метод визначення МДА в моноцитах полягає у визначенні кількості ТБК-активних
продуктів в досліджуваних пробах [12]. В основу тіобарбітурового методу
покладено визначення концентрації забарвленого комплексу, що утворюється
внаслідок реакції малонового діальдегіда (МДА) з двома молекулами
тіобарбітурової кислоти (ТБК) в кислому середовищі при температурі 90-1000С.
Максимум світлопоглинання утвореного комплексу знаходиться в області 532 нм. За
допомогою даного методу визначається МДА, присутній в біологічному субстраті та
МДА, що утворюється безпосередньо під час аналізу при нагріванні проби в
кислому середовищі. До 0,1 мл суспензії моноцитів додавали 0,1 мл розчину
хлориду заліза (270мг FeCl3?6Н2О в 100 мл дистильованої води), 1,5мл
гліцинового буферу (0,2 моль/л, рН=3,6), 1,5 мл розчину ТБК (50 мг ТБК на 10 мл
дистильованої води та 30 мг додецилсульфату, нагрівати до розчинення), 0,1 мл
бутилокситолуолу. Суміш витримували протягом 15 хвилин на водяній бані при
температурі 90-1000С, охолоджували до кімнатної температури, після чого
додавали 1мл крижаної оцтової кислоти та 1мл хлороформу. Одержану суміш
струшували, після чого центрифугували при 2000 об/хв протягом 5 хвилин.
Кількість продуктів реакції визначали за оптичною щільністю на
спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 532 нм в кюветі з товщиною оптичного
шару 1 см.
Для проведення розрахунків використовували формулу:
Д
С = ----------- ,
Е
де Д – оптична густина біологічного матеріалу;
Е – коефіцієнт екстінкції, що дорівнює 1,56.105 (М-1Чсм-1)
Кількість
- Киев+380960830922