РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкти досліджень та реактиви
Дослідження були проведені на 150 нелінійних щурах - самцях із початковою масою
120-180 г. Тварин утримували на стандартному харчовому раціоні віварію. Щурів
забивали шляхом декапітації. Об’єктом дослідження були нирки, печінка та кров.
У роботі використовували гомогенні препарати нирок та печінки, а також
сироватку та плазму крові.
При проведенні досліджень використовували наступні реактиви: L- адреналін, азид
натрію фірми “Fluka”, Швейцарія; 1-хлор-2,4-дінітробензол, сахароза – “Serva”,
Німеччина; колхіцин, відновлений глутатіон – “Sigma”, США; ЕДТА – “Reanal”,
Угорщина; Набір реактивів для визначення активності g-GT – “Lachema”, Чехія.
Інші реактиви кваліфікації х.ч. або ч.д.а. Для приготування водних розчинів та
середовищ інкубації використовували бідистильовану воду.
2.2. Умови введення ксенобіотиків
I. Хронічна сумісна інгаляційна дія на організм тварин комплексу ксенобіотиків:
оксидів азоту (II, IV), діоксиду кремнію аморфного гідрофобного, свинцю, радону
та його ДПР (в експериментальних камерах 4 години на день, 5 разів на
тиждень).
Оксиди азоту (II, IV) одержували шляхом дії на нітрит натрію 50% розчином
сірчаної кислоти. Контроль за концентрацією оксидів азоту в експериментальних
камерах здійснювали фотометрично через кожні 30 хвилин [255]. Середній рівень
оксидів азоту в повітрі камер відповідав 10 мг/м3.
Експериментальним аерозолем був обраний гідрофобний діоксид кремнію з розміром
частинок менш ніж 1 мкм із питомою поверхнею 100 м2/г. Рівень запилення у
дослідних камерах дорівнював 35 мг/м3.
Середня концентрація Pb2+ (ацетат свинцю) у повітрі експериментальних камер
відповідала 0,05 мг/м3.
Радон надходив до експериментальних камер із розташованого в них
радійвміщуючого шламу. Для контролю за його концентрацією в ході експерименту
був використаний метод визначення питомої об'ємної активності цього газу у
повітрі за допомогою радіометра об'ємної активності радону "Alpha GUARD",
Німеччина. Модифікація даного приладу дозволяє паралельно контролювати
параметри атмосферного повітря: тиск, температуру, вологість. Загалом питома
об'ємна активність радону у середньому дорівнювала 2840 Бк/м3.
Тварин розділили на групи в залежності від завдань експерименту:
Група №#1 – контрольні тварини для групи №#2;
Група №#2 – тварини, що зазнали дії комплексу ксенобіотиків протягом трьох
місяців;
Група №#3 – контрольні тварини для групи №#4;
Група №#4 – тварини, що зазнали дії комплексу ксенобіотиків протягом шести
місяців;
Група №#5 – контрольні тварини для групи №#6;
Група №#6 – тварини, що зазнали дії комплексу ксенобіотиків протягом дев’яти
місяців;
Група №#7 – контрольні тварини для групи №#8;
Група №#8 – тварини, що зазнали дії комплексу ксенобіотиків протягом дванадцяти
місяців.
II. Хронічна дія радіоактивного фактору. Одноразово інтратрахеально вводили
радійвміщуючий шлам - 13,5 мг/100 г маси піддослідної тварини, питома об'ємна
активність 222Rn дорівнювала 2840 Бк/м3.
Група №#9 – контрольні тварини для групи №#10 та №#11;
Група №#10 – тварини, що зазнали дії радіоактивного фактору протягом дев’яти
місяців;
Група №#11 – тварини, що зазнали дії радіоактивного фактору протягом дванадцяти
місяців.
У хронічних експериментах концентрації діючих речовин дорівнювали порогу
хронічної дії.
III. Гостра дія сульфату нікелю. Проводили одноразове внутрішньочеревне
введення 10 мМ розчину сульфату нікелю (доза: 1,6 мг солі на 100 г ваги тварини
– LD50, експозиція 24 години).
Група №#12 – контрольні тварини для групи №#13;
Група №#13 – тварини, що зазнали гострої дії сульфату нікелю.
Надалі в таблицях та в тексті будуть використані лише номери груп тварин (№#),
значення яких наведені вище. Контролем були інтактні тварини.
2.3. Отримання препаратів нирок та печінки; сироватки та плазми крові
Отримання гомогенатів нирок та печінки проводили згідно з методом [21].
Після декапітації щурів розтинали, вилучали нирки та печінку. Отримані органи
занурювали у 0,9% розчин NaCl. На наступному етапі проводили їх перфузію
фізіологічним розчином, а наприкінці 10 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) з 250 мМ
сахарози. М’яку гомогенізацію тканин нирок та печінки здійснювали в механічному
гомогенізаторі Поттера (t = 4° С, зі швидкістю обертання товкачика - 500
об./хвилину, час - 3 хвилини, співвідношення мас нативної тканини та 10 мМ
трис-HCl буфера (рН 7,5) з 250 мМ сахарози - 1:5).
Гомогенат центрифугували 30 хвилин при 5000 g (t = 4°С), після чого отриману
надосадову рідину фільтрували через декілька шарів марлі та використовували в
подальших дослідженнях.
Сироватку крові отримували згідно з методикою [256]. Венозну кров набирали в
скляну пробірку без антикоагулянта і ставили її на 4 години у водяну баню (t =
37° С). Відбирали супернатант, центрифугували його 10 хвилин при 350 g та
збирали сироватку (надосадову рідину) для подальших досліджень.
2.4. Визначення вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів
Для об'єктивної оцінки перебігу ПОЛ, визначали вміст його продуктів:
початкового, проміжного та кінцевого [21].
Вміст дієнових кон’югатів (ДК) ненасичених вищих жирних кислот визначали за
методом [257]. Принцип методу полягає в тому, що за умов перебігу ПОЛ в
структурі поліненасичених жирних кислот відбувається перегрупування етилен
розділених подвійних зв’язків у спряжену дієнову структуру, що супроводжується
появою нового максимуму в спектрі поглинання – лмакс=233 нм.
Хід визначення: у поліетиленову центрифужну пробірку з пробками вносили 1 мл
гомогенного препарату нирок чи печінки (або 1 мл сироватки) та струшували на
механічному струшувачи з 9 мл екстрагуючої суміші гептану з ізопропіл
- Київ+380960830922