РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИКИ
2.1. Культура клітин
Клітини лінії LNCaP (American Type Culture Collection) культивували в
середовищі RPMI 1640 (фірми “ Biowhittaker”, Франція) з додаванням 5 ммоль/л
L-глутаміну (фірми “Sigma”), 10%-ї ембріональної бичачої сироватки (фірми
“Poly-Labo”, Франція), 50000 од/л пеніциліну та 50 мг/л стрептоміцину. Клітини
вирощували у флаконах, об’ємом 50 мл при 37 оС в інкубаторі зі зволоженою
атмосферою 95% повітря та 5% СО2. Для електрофізіологічних досліджень клітини
висаджувались в чашки Петрі, покриті поліорнітином (фірми “Sigma”), і
використовувались протягом 4-6 діб.
Для з’ясування АТФ-чутливості каналів плазматичної мембрани ми виключали
ендогенну продукцію АТФ метаболічними інгібіторами (мкмоль/л): 40 олігоміцину
(макролідного антибіотика, блокатора мітохондріальної АТФ-ази і переносу
фосфорильної групи [140]), 5 йодоацетату (інгібітора ферменту
гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогенази, відповідального за один з найважливіших
етапів гліколізу [132]), 20 ротенону (інгібітора електронного транспорту в
мітохондріях [214]). При цьому перед використанням в електрофізіологічному
досліді клітини інкубувались протягом 25-35 хвилин в середовищі зі 100 нмоль/л
ротенону та 5 ммоль/л 2-деоксиглюкози (мембранопроникного інгібітора гліколізу
[49]), а в ході самого експерименту діалізувались штучним внутрішньоклітинним
розчином з олігоміцином, йодоацетатом та ротеноном. Метаболічні інгібітори
додавались із концентрованих розчинів, розведених в DMSO. Кінцева концентрація
DMSO у внутрішніх розчинах складала 0,15%.
Для нейроендокринного диференціювання клітини інкубувалися з 1 ммоль/л ДБ-цAMФ
(N6,2'-O-dibutyryladenosine 3':5' - cyclic monophosphate Sodium salt, фірми
“Sigma”) протягом трьох діб, починаючи з другої доби після пасажу. Також
використовувалась методика диференціювання клітин в нейроендокринний фенотип
шляхом тривалої інкубації в безстероідному середовищі.
Безстероідне культуральне середовище готувалося таким чином. В трубку, що
містила 10% активоване вугілля додавали ембріональну бичачу сироватку і потім
трубку збовтували 16 годин при 4оС. Після 1 години центрифугування при 10000 g
і 4оС збирався осад і знову центрифугувався 30 хвилин при 27000 g. Остаточний
осад фільтрувався через 0,22 мкм фільтри. Перед використанням отриману таким
чином ембріональну бичачу сироватку витримували 30 хв при 56 оС. Власне
безстероідне культуральне середовище отримували при додаванні в середовище RPMI
1640 без фенолового червоного отриманої на попередньому етапі ембріональної
бичачої сироватки.
2.2. Електрофізіологічний експеримент і розчини
Мембранні струми в LNCaP клітинах реєструвалися з використанням методики
“петч-клемп” в конфігурації “ціла клітина” (див. блок-схему установки на рис.
2.1).
Основою методу є реєстрація струмів, що переносяться через невелику ділянку
мембрани, електрично ізольовану від навколишнього середовища за допомогою
скляної мікропіпетки [172]. Така ізоляція можлива завдяки унікальній здатності
скла утворювати високоомний контакт (1ё100 ГОм) з компонентами клітинної
мембрани. Високоомний контакт між піпеткою і мембраною разом з високою
чутливістю і низьким рівнем власного шуму підсилювача забезпечують можливість
реєстрації струмів у пікоамперному діапазоні, що відповідає струмам через
поодинокі канали. Пізніше метод був адаптований для виміру струмів усієї
мембрани (конфігурація "ціла клітина"). Для цього ділянку мембрани під
мікропіпеткою проривають, прикладаючи негативний тиск, і встановлюють
низькоомний доступ до внутрішньоклітинного середовища, що дозволяє здійснювати
фіксацію потенціалу цілої клітини. Локальна фіксація потенціалу має цілу низку
переваг у порівнянні з класичною двоелектродною фіксацією, запропонованою в
50-х роках Годжкіном і Гакслі для дослідження іонної провідності мембрани
гігантського аксона кальмара [105].
Рис. 2.1. Блок-схема установки для реєстрації інтегральних струмів плазматичної
мембрани клітин лінії LNCaP карциноми простати людини.
Насамперед у рамках методу "петч-клемп" фіксація потенціалу здійснюється за
допомогою однієї мікропіпетки, що значно полегшує роботу з клітинами невеликого
розміру. "Петч-клемп" дозволяє також досягти значно більш низького рівня шумів,
забезпечуючи, таким чином, реєстрацію і наступний аналіз низькоамплітудних
струмів. Метод "петч-клемп" у конфігурації "ціла клітина" забезпечує швидкий
діаліз внутрішньоклітинного середовища.
В наших експериментах чашку Петрі з клітинами встановлювали в препаратоводій,
розташований на предметному столику інвертованого мікроскопа з оптикою (Zeizz,
Німеччина). Скляні мікропіпетки виготовлялися з тугоплавкого скла (зовнішнього
діаметра 1,5 – 1,75 мм). Піпетки мали діаметр кінчика 1 - 2 мкм і опір 2 - 4
МОм при заповненні стандартним штучним внутрішньоклітинним розчином. Піпетку
закріплювали в полікарбонатному тримачі, приєднаному до попереднього
підсилювача Dagan pc-one, (Dagan Corp., CША). Попередній підсилювач містився на
мікроманіпуляторі. Заповнену розчином піпетку опускали в позаклітинний розчин і
компенсували потенціал кінчика, що всередньому складає 4 - 5 мв. Гігаомні
контакти між клітинною мембраною і піпеткою утворювали, притискаючи піпетку з
прикладеним до неї невеликим позитивним тиском до поверхні клітини і потім
скидаючи цей тиск до атмосферного. Утворення гігаомного контакту контролювали в
режимі фіксації потенціалу, подаючи на мембрану прямокутні деполяризуючі
імпульси амплітудою 10 мв. Після утворення щільного контакту піпетки з
поверхнею мембрани проводилась компенсація ємності піпетки щодо зовнішнього
розчину. Ко
- Київ+380960830922