РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об`єкти досліджень
Об`єктом досліджень були ізольовані кільцеві сегменти правої та лівої легеневих
артерій та грудної аорти 62 дорослих щурів лінії Wistar обох статей масою 250 –
300 г, які утримувались на стандартному раціоні у віварії інституту. Тварини
були евтоназовані шляхом декапітації із наступним знекровленням, після чого їх
грудна клітка була вскрита, виділені серце разом з легенями та грудною аортою
та відразу перенесені у стандартний буферний розчин Кребсу кімнатної
температури.
Після видалення, серце разом з легенями та грудною аортою за допомогою
препарувальних голок фіксували на парафіновому дні препарувальної чашки
заповненої розчином Кребсу та видаляли грудну аорту та легеневі артерії.
Виділені судини під бінокуляром звільняли від сполучної тканини та згустків
крові. Відпрепаровані ділянки судин нарізали на кільцеві сегменти шириною 1 – 2
мм та внутрішнім діаметром 1,5 – 2 мм. При цьому, ділянку грудного відділу
аорти розрізали на кільцеві сегменти під кутом близько 45°, оскільки стінка цих
судин складається переважно з кільцевих м`язових шарів. Отримані судинні
препарати залишали у розчині Кребса при кімнатній температурі на 45 – 60 хв. до
перенесення їх у робочу суперфузійну камеру.
2.2. Розчини та речовини
2.2.1. Розчини.
Базовим позаклітинним розчином, що використовувався для
препарування та суперфузії судинних сегментів, був стандартний буферний розчин
Кребсу наступного складу:
речовина концентрація (мМ/л)
NaCl 133
NaHCO3 16,3
KCl 4,7
MgCl2 х 6Н2О 1,05
NaH2PO4 1,38
CaCl2 2,75
глюкоза 7,82
HEPES 10
рН буферного розчину Кребсу складав 7,3 – 7,4. Для приготування буферного
розчину Кребсу використовували хімічно чисті солі компанії «Sigma» (США), які
розчиняли у дистильованій воді в еквімолярних концентраціях.
2.2.2. Реактиви.
В дослідах були використані наступні речовини: артерінол (норадреналін,
норепінефрин) «Sigma» (США), ацетилхолін «Sigma» (США), 2-деокси-D-глюкоза
«Sigma» (США), 18b-гліциретинова кислота «Sigma» (США), монойодацетат «Sigma»
(США), піруват натрію «Sigma» (США), сапонін «Sigma» (США), мезатон
(фенілефрин) «Здоров`я» (Україна), ліпін (фосфатидилхолінові ліпосоми)
«Здоров`я» (Україна).
2.3. Методика реєстрації скоротливої активності ізольованих судинних препаратів
В дослідах тензометрично рєстрували зміни тонусу ізольованих судинних
препаратів. Реєстрація скоротливої активності ізольованих судинних препаратів
здійснювалась в ізометричному режимі за допомогою ємнісних датчиків напруження.
Запис скоротливої активності ізольованих судинних препаратів здійснювали на
папері в прямокутній системі координат за допомогою багатоканального фізіографа
«Cole Parmer» (США). Блок–схему тензометричної установки для реєстрації
скоротливої активності ізольованих судинних препаратів подано на рисунку 2.1.
Рис.2.1. Блок–схема установки для реєстрації скоротливої активності ізольованих
судинних препаратів. 1 – ємкість із перфузійним розчином; 2 – перистальтичний
насос; 3 – нагрівач із термодатчиком; 4 – робоча камера; 5 – судинні препарати;
6 – тензодатчики поєднані із мікроманіпуляторами та підсилювачами; 7 – блок
живлення; 8 – багатоканальний фізіограф.
Судинні сегменти розміщували у робочій плексигласовій камері об`ємом 0,5 мл із
проточним буферним розчином Кребсу, де закріплювали на двох сталевих гачках,
один з яких був стаціонарно вмонтований до стінки камери, а інший поєднаний із
штоком тензодатчику. Після цього судинні сегменти підлягали пасивному
розтягненню із силою 400 мг для препаратів легеневих артерій та 2000 мг для
препаратів грудної аорти. Таке навантаження дозволяє отримати оптимальну силу
скорочення судинних препаратів.
Судинні сегменти в камері суперфузувались буферним розчином Кребсу із сталою
швидкістю 1,5 мл/хв. за допомогою 4-х канального перистальтичного насосу IPS
ISM 930 «Ismatec» (Німеччина). Суперфузійний буферний розчин Кребсу
термостатували із постійною температурою 37°С за допомогою системи підігріву
розчину, яка включала в себе два ступені нагрівання, розміщені під дном камери,
та у проксимальній ділянці поєднаної з камерою суперфузійної системи. Зворотний
контроль температури здійснювали за допомогою термодатчиків, розташованих на
виході суперфузійної системи із камери, вході до камери та власне в камері.
Перфузійний буферний розчин Кребсу аерували газовою сумішшю 21 % – O2, 5 % –
CO2 та 74 % – N2. Аплікацію усіх застосованих фармакологічних агентів
здійснювали за допомогою суперфузійної системи.
Реакцією, що реєструється, вважали амплітуду відхилення пера фізіографа, яка
вимірювалась згідно калібрувального сигналу.
До початку експерименту судинні сегменти витримували у суперфузійній камері
протягом 40 – 60 хвилин. Після цього починали періодичну стимуляцію судинних
препаратів шляхом деполяризації клітинної мембрани ГМК за допомогою
гіперкалієвого буферного розчину із вмістом іонів K+ 60 мМ до отримання
стабільних скоротливих відповідей, коли останні три скоротливі реакції були
подібні за амплітудою та кінетикою. Таку процедуру здійснювали з метою
досягнення оптимального режиму роботи судинних гладеньких м`язів. Враховуючи,
що судинні препарати у вихідному стані мають слабо виражений базальний тонус,
дослідження скоротливих реакцій проводились на фоні попереднього скорочення ГМК
норадреналіном в концентрації 3х10-7 M. З метою перевірки цілісності
ендотеліального шару або успішної деендотелізації, в залежності від умов
експерименту, на початку кожного експерименту попередньо скорочені
норадрен
- Київ+380960830922