РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика експериментальних тварин
Експериментальні дослідження проведені на 1244 нелінійних білих мишах-самцях масою 18-28 г та на 245 білих щурах лінії Вістар масою 180-250 г, які були розведені у віварії Державної установи "Інститут фармакології та токсикології АМН України". Утримання та евтаназія дослідних та контрольних тварин здійснювались у відповідності до законодавства України, правил Європейської Конвенції щодо захисту хребетних тварин, які використовуються в експериментальних дослідженнях та інших наукових цілях [82, 150].
2.2. Принципи експериментальної оцінки протисудомної активності потенційних антиепілептичних засобів
Відбір препаратів із потенційною протисудомною активністю проводився з допомогою загальноприйнятих експериментальних моделей епілепсії: моделі коразолових (пентилентетразолових) судом, максимального електрошоку (МЕШ) та моделі кіндлінгу [36].
2.2.1. Максимальний електрошок (МЕШ)
Максимальний електрошоковий тест використовується для виявлення речовин, що запобігають поширенню судом. Вважається, що властивість препарату запобігати максимальним судомам при проведенні електрошоку пов'язане з його властивістю запобігати поширенню імпульсу по нервовій тканині. Крім того, допускається, що протидія розвитку судом, викликаних максимальним електрошком може свідчити про потенційну ефективність досліджуваного препарату при терапії великих судомних нападів [8]. Таким чином, МЕШ використовують для оцінки здатності сполук запобігати розповсюдженню судомного нападу, оцінці потенційної ефективності препаратів, для лікування великих моторних пароксизмів (grand mal) (8, 177(.
МЕШ відтворювали за допомогою електростимулятора "ИСЭ-1" (безперервна серія імпульсів, тривалість імпульсів 10 мс, 50 V, 0,5 с). Струм подавали через корнеальні електроди з маленькими зажимами. Вушні раковини тварин змочували фізіологічним розчином. Визначали кількість мишей із тонічними судомами. Критерієм протисудомної активності сполуки вважали повний захист від тонічних судом.
2.2.2. Хемоконвульсанти
Властивість препарату запобігати судомам, викликаним уведенням пентилентетразолу, пов'язана з можливістю підвищувати поріг збудливості нейронів. Вважається, що селективна дія в тесті з коразолом говорить про потенціальну ефективність препарату при короткочасних пароксизмах та короткочасній непритомності при малих судомних нападах [8, 54, 188].
Для відтворення експериментальних коразолових судом використовували хемоконвульсант пентилентетразол (коразол) фірми "Sigma". Для моделювання клоніко-тонічних судом коразол уводили інтраперитонеально в дозі 90 мг/кг. Інтенсивність судомного нападу оцінювали за допомогою 5-бальної шкали, узявши за основу наступні критерії (враховуючи кількість тварин, що загинули) [162]:
0 - відсутність судомної активності;
1 - гіперкінезія;
2 - тремтіння, посмикування;
3 - клонічні судоми передніх лап з підйомом на задні лапи;
4 - виражені тоніко-клонічні судоми, падіння тварини на бік, наявна фаза тонічної екстензії;
5 - повторні клоніко-тонічні судоми, втрата пози, загибель.
Враховували також латентний період розвитку перших судомних проявів (посмикування, стрибки), кількість тварин, в яких розвивався розгорнутий клоніко-тонічний напад, летальність. Протисудомним впливом уважали захист тварин від розвитку клонічних, тонічних судом, летальності.
Всі досліджувані сполуки вводили у відповідних концентраціях з розрахунку 0,1 мл розчину на 10 г ваги тіла тварин. Гідрофобні сполуки диспергували у водній суспензії з Твіном-80 (0,2% у співвідношенні маса/об?єм у 0,9% розчині хлориду натрію).
З метою виявлення нових потенційних протиепілептичних засобів адекватним є використання різноманітних моделей судом, спричинених хімічними агентами. Окрім коразолу використовують пікротоксин, стрихнін, тіосемикарбазид, бікукулін, N-метил-D-аспартат, пеніцилін, енкефалін та ін. Зазначені методи, з одного боку, дозволяють створити судоми, що відповідають проявам тих чи інших симптомів епілепсії, з іншого - визначити деякі напрями вивчення можливих механізмів протисудомної дії досліджуваних сполук. Ми у своїх дослідженнях вивчали протисудомну активність сполук на моделях судом, викликаних хемоконвульсантами: коразолом, пікротоксином, стрихніном та тіосемікарбазидом (фірми "Sigma", США).
Судомна дія стрихніну пов'язується з антагонізмом у відношенні гальмівного впливу гліцину на синаптичну передачу вставних нейронів. При дії стрихніну спостерігаються характерні стрихнінові судоми, при яких тварини гинуть на висоті тонічної екстензії [100, 177,194].
При уведенні тіосемікарбазиду пригнічується синтез гальмівного медіатора - ГАМК, що призводить до розвитку клоніко-тонічнх судом, на висоті яких спостерігається загибель тварин [8].
Механізм дії пікротоксину пов'язують з блокадою Сl-іонофора на ГАМК-рецеторному комплексі [97, 134, 194].
Зважаючи на зміну чутливості тварин до дії хемоконвульсантів [174, 194] для моделювання клоніко-тонічних судом коразол уводили в діапазоні доз 90-110 мг/кг, стрихнін - у діапазоні доз 1,5 - 2,5 мг/кг, пікротоксин - у дозі 6 мг/кг, тіосемікарбазид - у дозі 20 мг/кг.
Інтенсивність судомного нападу оцінювали за допомогою 5-бальної шкали [162].
2.2.3. Кіндлінг
Для прогнозування потенційної протиепілептичної активності нових сполук необхідним і важливим етапом досліджень є з'ясування здатності сполук пригнічувати епілептогенез на кіндлінговій судомній моделі. Існують два різновиди моделей кіндлінгу: це електричний та фармакологічний ?104, 105?. Електричний кіндлінг відтворюється повторними електростимуляціями високочастотними імпульсами лімбічних або неокортикальних ділянок мозку щурів, що призводить до зміни відповіді на електростимуляцію і формування судомних нападів. Фармакологічний кіндлінг може бути відтворений шляхом повторних ін'єкцій допорогових доз (тобто доз, що при од