РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Используемые материалы
Объектами исследования явились 2248 образцов возбудителей гнойно-септических
заболеваний, выделеные от 2117 больных. Отобрано 106 больных, инфицированных
золотистым стафилококком и 94 пациента, инфицированных эпидермальним
стафилококком для проведения клинического анализа со сравнением данных
ПЦР-анализа.
Исследования проведены в диагностической лаборатории Одесской областной детской
клинической больницы и Южного биотехнологического центра Украинской академии
аграрных наук и Министерства образования и науки Украины. Проанализированы
данные о лечении больных в указанный период в отделениях: анестезиологии,
реанимации и интенсивной терапии, реанимации новорожденных и гнойной хирургии.
Оценены и проанализированы данные, полученные после проведения
микробиологического исследования с исследованием антибиотикорезистентности, а
также в сопоставлении с клиническими диагнозами в динамике.
Использованы среды : Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агар, селенитовый бульон,
Клиглер, желточно-солевой агар, стандартные дифференциально-диагностические
среды для родовой и видовой идентификации - НПФ "Симеста – ВААЛ “ ( Одесса).
Для получения антибиотикограммы использовали метод диффузии антибиотиков с
дисков в агаре, применяя диски с антибиотиками фирмы “Ranbaxy “ ( Индия), НПФ “
Симеста – ВААЛ” ( Одесса) .
В работе использованы штаммы: Staphylococcus aureus № 285, Соwаn 1 (продуцент
протеина А), ATTC 25923, 209p; Staphylococcus epidermidis № 287, № 286, № 284,
и др.; из которых были выделены ДНК; маркеры молекулярного веса pUC Mix;
фланкирующие праймеры к данным микроорганизмам, поставлены отделом молекулярной
диагностики и генной дактилоскопии Государственного научного центра Российской
Федерации "Гос НИИ Генетика" ( Москва).
Произвольные праймеры
Р-53 5' - GTC TAA GTC G-3'
P-54 5' - GTT AGG AGA C-3'
P-64 5' - CCG GCA GCA AAA TG-3'
синтезированы на автоматическом ДНК-синтезаторе "Applied Biosistems 380B"
цианофосфорамидитным методом [63].
2.2. Методы детекции стафилококков и определение их антибиотикорезистентности.
Взятие материала.
Забор материала осуществлялся при соблюдении правил асептики. Кожу вокруг раны
обрабатывали антисептиком, удаляли с помощью стерильной салфетки некротические
массы, детрит, гной. Материал брали стерильным тампоном, круговыми
вращательными движениями от центра раны к периферии. Пробы для
бактериологического и микробиологического исследования забирали отдельным
тампоном. При наличии в ране дренажей отделяемое из них забирали шприцом в
количестве 1-2 мл и помещали в стерильную пробирку.
Забор крови
- Взятие крови проводили на высоте лихорадочного периода до начала химиотерапии
или через 12-24 часа после последнего введения препарата.
- Забор крови проводили с соблюдением правил асептики. Использовали одноразовые
шприцы с иглами для венопункции или одноразовые системы для взятия крови.
Материал сразу засевался на питательные среды.
- Кровь брали у постели больного или в перевязочной, тут же засевали на
питательные среды. Кожу над пунктируемой веной обрабатывали 70% спиртом, затем
5% настойкой йода и опять спиртом. Венопункцию проводили после полного
высыхания дезинфектанта.
Материал из носовых ходов забирали с помощью сухого стерильного тампона, а из
зева – с помощью увлажненного стерильного ватного тампона. Мазки из носа и
глотки брали разными тампонами. Материал из глотки и с миндалин забирили
натощак или не ранее чем через 3-4 часа после еды. Мокроту для исследования
забирали либо после ее откашливания, а в случае интубации трахеи – при помощи
стерильного катетера отсоса со специальной насадкой для забора материала.
Спинномозговую жидкость для исследования брали при проведении по показаниям
лечебно-диагностической люмбальной пункции в стерильные пробирки по обычной
методике.
Из костномозгового канала при остеомиелите материал получали из установленных в
костномозговой канал дренажных игл при аспирации шприцом и сразу помещали в
стерильную пробирку.
Взятие материала из абсцессов, флегмон, при лимфадените проводили с соблюдением
правил асептики аспирацией шприцом содержимого патологического очага. Материал
доставлялся в лабораторию сразу после забора или в течение часа и немедленно
засевался на питательные среды. Затем, проводили бактериологическое
исследование материала.
Методика бактериологического анализа антибиотикорезистентности.
После забора нативного материала проводили бактериоскопичексое исследование.
При этом, приготовление материала и окраска его по Граму осуществлялась по
общепринятой методике [2].
Посев материала. Кровь засевали непосредственно у постели больного. После
забора из вены проводили посев 5-10 мл крови на 50-100 мл сахарного бульона.
Посевы инкубировали при +37 оС . Ежедневно, в течение первых трех дней, а затем
на 5 и 7-е сутки производили высев на чашку с кровяным агаром. Посевы на
кровяном агаре инкубировали в термостате 18-24 часа. Отсутствие роста
стафилококков при высеве из сахарного бульона позволяло выдать отрицательный
ответ.
Экссудат, спинномозговую жидкость, гной из закрытых очагов засевали на чашки с
кровяным агаром и пробирки с сахарным бульоном. Посевы инкубировали при +37 оС
в течение 18 часов, затем проводили высев из сахарного бульона на чашки с
кровяным агаром, которые выдерживали 18 часов при +37 оС. Параллельно,
клинический материал засевался на чашки с ЖСА с пониженным содержанием натрия
хлорида. Для выделения других возможных возбудителей проводили параллельный
посев на соответствующие плотные питательные среды. В дал