РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ дослідження
Як об’єкт дослідження використовували препарат рекомбінантної людської
Cu-Zn-супероксиддисмутази (рексод), одержаний в ТОВ «РЭСБИО» (м. С.-Петербург,
РФ) з культури штаму дріжджів-продуцентів Saccharomyces cerevisiae Y 2134,
отриманих ТОВ НПП "ТРИС" (м. Москва, РФ). Рексод – це ліофільно висушений білий
порошок із блакитним відтінком, без запаху та смаку, гігроскопічний, добре
розчинний у воді та етанолі. Температура денатурації рексод – + 101°С.
Активність рексод – 480 000 од/мг білка (за методом реакції окислювання
кверцетину). Рексод містить 0,96 мг/мг білка, препарат стабільний при рН
4,0-10,5. Термін зберігання 3 роки при температурі 0°-20°С. Для вирішення
поставлених завдань використовували таку схему дослідження (схема 3):
Схема 3. Доклінічне вивчення рексод на різних етапах розвитку інсулінової
недостатності
Усі дослідження на тваринах проводили згідно з вимогами Європейської конвенції
із захисту тварин, що використовуються для експериментальних і наукових цілей
(м. Страсбург, 1985), та національних «Загальних етичних принципів
експериментів на тваринах» (Україна, 2001) [59].
На першому етапі дослідження оцінювали антиокислювальні та цукрознижувальні
ефекти рексод у інтактних тварин. Рексод щоденно вводили внутрішньом’язово у
дозі 0,065 мг/кг протягом 2-х місяців. Контрольна група тварин отримувала
внутрішньом’язово 0,2 мл ізотонічного розчину натрію хлориду (що був
аналогічним об’єму введеної рексод). Вміст глюкози у крові визначали
глюкозооксидазним методом за допомогою ферментативного аналізатора глюкози
«Ексан-Г» [59, 144].
Наступним етапом експериментальних досліджень було встановлення впливу рексод
на основні метаболічні прояви первинної інсулінорезистентності на стадії
переддіабету.
Результат метааналізу трьох проспективних досліджень (ІRAS, MCDC й SAHS),
тривалістю 5-7,5 років, у яких відслідковувалися інциденти розвитку цукрового
діабету в різних групах хворих із метаболічними порушеннями показав, що в осіб
із метаболічним синдромом (МС) і порушенням толерантності до глюкози ризик
розвитку цукрового діабету в найближчі 5 років становить 40%, що в 2,5 рази
вище, чим у групі хворих з порушенням толерантності до глюкози без
метаболичного синдрому. У хворих із МС і нормальною толерантністю до глюкози
ризик розвитку цукрового діабету був майже в 3 рази вище, у порівнянні із
практично здоровими людьми [45]. Тож становило інтерес дослідити ефективність
антиоксидантної терапії при МС.
Інсулінорезистентність відтворювали у безпородних білих щурів - самців шляхом
перорального введення фруктози (200 г/л) з питною водою протягом 2 місяців.
Дана модель відображає метаболічні зміни, які характерні для метаболічного
синдрому (МС): гіпертригліцеридемію, інсулінорезистентність та зниження
толерантності до глюкози. Рексод вводили внутрішньом’язово у
лікувально-профілактичному режимі протягом 2-х місяців.
Для відтворення первинної інсулінорезистентністі іншого ґенезу використовували
дексаметазонову модель. Дана модель приводить до розвитку інтолерантністі до
глюкози та інсулінорезистентністі, але не викликає змін у базальній глікемії
[68, 72, 100]. Патологію викликали шляхом введення щурам віком 3 місяці
дексаметазону у дозі 0,125 мг/кг підшкірно протягом 13 діб за методом Okamoto
H. [59, 144]. Рексод вводили внутрішньом’язово у лікувально-профілактичному
режимі протягом 15 діб.
У зв’язку з тим, що глюкокортикостероіди впливають на стан серцево-судинної
системи, ми досліджували електрокардіографічні показники з використанням
електрокардіографа ЕК1Т 03 М2 у другому стандартному відведенні [58]: частоту
серцевих скорочень (ЧСС), систолічний показник (СП) та тривалість інтервалу
QТ.
Для визначення гастропротекторних властивостей [59] рексод при ДМ у щурів усіх
тварин було розподілено на такі групи: 1) інтактні тварини, 2) тварини з ДМ,
яких не лікували, 3) тварини з ДМ, яких лікували рексод та 4) тварини з ДМ,
яких лікували a- токоферолу ацетатом. Всього проведено 4 серій дослідів.
При визначенні гастропротекторних властивостей рексод при ДМ у щурів проводили
макроскопічне вивчення СОШ за показниками: кількість тварин з виразками в групі
(Тв, %), середня площа виразок у тварин в групі (Sв, бали), виразковий індекс
(ВІ), противиразкова активність (ПВА, %) щурів за загальноприйнятими методами
[59].
Для дослідження ефективності рексод при відносній інсуліновій недостатності
використовували модель неонатального стрептозотоцинового діабету, яку
відтворювали шляхом внутрішньоочеревинного одноразового введення
стрептозотоцину у дозі 100 мг/кг щурам на другу добу після народження.
Для вивчення терапевтичної дії рексод на розвиток неонатального
стрептозотоцидного діабету, тварини отримували рексод впродовж 60 днів у дозі
0,065 мг/кг, починаючи з п’ятого дня після ін’єкції стрептозотоцину. В якості
препаратів порівняння використовували нікотинамід (ЕД50 - 25 мг/кг маси тіла)
та a-токоферолу ацетат (ЕД50 - 50 мг/кг), які часто застосовують у комплексній
терапії ЦД [59]. Дослідні тварини отримували a-токоферолу ацетат і нікотинамід
у ті ж самі терміни, що і рексод. Інтактну групу складали щури, яким вводили
внутрішньом’язово ізотонічний розчин натрію хлориду, що був аналогічним об’єму
введеного стрептозотоцина.
Через вісім тижнів після ін’єкції стрептозотоцина у дослідних груп тварин
визначали рівень глікемії, вміст ферментів вуглеводного обміну, стан
ліпопротеїдного обміну та білок-синтезуючої активності клітин печінки згідно
вимог ДФЦ МОЗ України до доклінічни