РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Обґрунтування вибраного напрямку дослідження
Дані експериментальних досліджень, досвід застосування в клініці доксорубіцину та інших антрациклінових антибіотиків свідчать, що поряд з високою протипухлинною активністю, доксорубіцину властива й висока токсичність, яка проявляється ураженням різних органів, насамперед, серця, нирок, печінки.
Вищезазначене пояснює необхідність подальшого пошуку ефективних шляхів корекції порушеного гомеостазу при дилятаційній кардіоміопатії і удосконалення профілактики даної патології.
Встановлено, що при доксорубіциновій кардіоміопатії порушуються кардіо- і системна гемодинаміка, біохімічні, морфологічні показники. В якості домінуючого патогенетичного механізму ушкодження серця розглядають активацію доксорубіцином пероксидного окислення ліпідів. Виникаючі в серцевому м'язі дистрофічні зміни лежать в основі енергетично-динамічної недостатності серця [104]. Тому з метою захисту міокарда був визначений метаболітний препарат тіотриазолін, широкий спектр антиоксидантної активності якого підтверджений результатами численних експериментальних і клінічних досліджень [196].
В клінічній практиці часто зустрічається фторидна інтоксикація, яка може супроводжуватися порушенням кардіогемодинаміки [70, 83, 162]. Це стало підставою для дослідження тіотриазоліну як можливого кардіопротектора при фторидній інтоксикації.
Для вивчення кардіопротекторної активності тіотриазоліну використовували комплексний методичний підхід із застосуванням фармакологічних, токсикологічних, біохімічних, фізіологічних, морфологічних, гістохімічних методів дослідження.
Досліди проведені на 120 статевозрілих білих щурах обох статей лінії Вістар масою 170-230 г, 100 білих нелінійних мишах масою 18-22 г, на 36 кролях породи Шиншила масою 2,6-4,5 кг. В експеримент тварин забирали після проходження карантину тривалістю 14 днів. Тварини знаходились на стандартному раціоні в умовах віварію НМУ при вільному доступі до води і їжі згідно Методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України [72].
Експерименти на тваринах виконано згідно Закону України "Про лікарські засоби" з врахуванням існуючих етичних норм та стандартів щодо проведення експериментальних досліджень (протокол № 13 від 31.10.2006 р. Комісії з питань етики НМУ імені О.О. Богомольця). Досліди проведені за "Правилами доклінічної оцінки безпеки фармакологічних засобів (GLP)" [24]. Евтаназію тварин виконували шляхом декапітації у відповідності з "Методическими рекомендациями по выведению лабораторных животных из эксперимента" [126].
Для проведення досліджень застосовували препарати: доксорубіцин-КМП (ВАТ "Київмедпрепарат", Україна, з 2006 р. - корпорація "ARTERIUM"), натрію фторид ("Гриндекс", Латвія), тіотриазолін (АТ "Галичфарм", Україна, з 2006 р. - корпорація "ARTERIUM").
2.2. Вивчення гострої токсичності
Визначення параметрів гострої токсичності на мишах в експерименті дає можливість з'ясувати характер і вираженість симптомів отруєння при одноразовому введенні медикаментів в максимальних дозах.
Визначення токсичності доксорубіцину і натрію фториду проводили при внутрішньоочеревинному введенні мишам після попереднього розчинення у воді для ін'єкцій.
В окремій серії дослідів за 1 годину до введення доксорубіцину і натрію фториду мишам внутрішньоочеревинно вводили тіотриазолін. За тваринами спостерігали 14 діб.
В перший день після введення за тваринами спостерігали безперервно. Враховували такі показники як інтенсивність та характер рухової активності, особливості поведінки, зовнішній стан та інші, які можуть бути застосовані для оцінки токсичного ефекту у відповідності з Методичними рекомендаціями Державного фармакологічного центру МОЗ України (Київ, 2001).
Реєстрували час розвитку інтоксикації та загибелі тварин, масу тіла, серця, легенів, печінки в день введення, масу тіла та органів тварин, що вижили на 3, 7, 14 день спостереження.
Вибір режиму дозування доксорубіцину, натрію фториду був обґрунтований результатами пошукової роботи і літературних даних [64, 70, 83, 96, 257, 305]. Для визначення ДЛ50 застосовували метод В.Б. Прозоровського [158] на підставі 8 спостережень. Кількісне визначення ДЛ50 та її похибки проводились згідно спеціальних таблиць.
2.3. Моделювання патологічних станів
Моделювання антрациклінового ушкодження серця у кролів здійснювали шляхом внутрішньовенного введення (у вушну вену) доксорубіцину в дозі 3 мг/кг маси один раз на тиждень протягом 4-х тижнів. Кумулятивна доза доксорубіцину становила 12 мг/кг маси. Тіотриазолін вводили вутрішньом'язово щоденно у дозі 125 мг/кг маси протягом 4-х тижнів. Така доза тіотриазоліну була визначена на основі літературних даних [12, 19, 23, 40, 145, 184, 196] та проведення досліджень з антитоксичних властивостей препарату.
Доксорубіцинову кардіоміопатію на щурах моделювали внутрішньом'язовим введенням доксорубіцину 1 раз на тиждень протягом 4-х тижнів в дозі 5 мг/кг. Тіотриазолін вводили внутрішньом'язово у дозі 150 мг/кг маси щоденно одночасно з введенням доксорубіцину протягом вказаного терміну.
Гостру фторидну інтоксикацію в експериментах на кролях здійснювали внутрішньовенним введенням натрію фториду в дозі 10 мг/кг та визначенням показників гемодинаміки через 40 хвилин. Тіотриазолін вводили в дозі 125 мг/кг внутрішньом'язово за 1 годину до натрію фториду.
2.4. Визначення показників діяльності серця та стану гемодинаміки у кролів
На підставі аналізу літературних джерел щодо фармакології тіотриазоліну та фармакотерапії цим препаратом різних захворювань, було доцільним вивчити кардіопротекторну дію цього медикаменту при доксорубіциновій кардіоміопатії. Доцільність проведення таких досліджень обумовлена тим, що препарат перешкоджає прогресивному зниженню скорочувальної спроможності серця, опт