РАЗДЕЛ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель и задачи настоящего исследования потребовали применения разнообразных иммунологических, биохимических, цитохимических и биофизических методов изучения функций иммунной системы и печени как у интактных животных, так и на модели экспериментального токсического гепатита с применением нового гепатопротектора гептрала и БАВ МИГУ-1. Подбор методов осуществлялся с учетом их адекватности, информативности, достоверности воспроизведения, а также соответствия современным направлениям изучения механизмов действия иммуномодулирующих и гепатопротекторных средств ?4, 46, 102, 126, 131, 133, 134, 152, 162, 168, 185, 213, 252, 294?.
2.1. Выбор модели экспериментального гепатита и обоснование дозировок изучаемых препаратов
Эскпериментальное поражение печени возможно при применении ряда промышленных токсических продуктов, гербицидов и ксенобиотиков, лекарственных препаратов и других веществ ?6, 19, 79, 100, 116, 118, 123, 195, 316?. Для моделирования гепатита на животных используется четырёххлористый углерод, изониазид, галактозамин, гидразин а также другие химические и лекарственные соединения ?49, 69, 104, 167, 194, 237, 262, 403?. Вместе с тем наиболее широко применяемой и хорошо изученной является модель гепатотоксичности, воспроизводимая с помощью ССl4 ?28, 58, 66, 80, 173, 188, 191, 240, 267, 284, 407, 409?. Известно множество методик воспроизведения поражения печени ССl4, предполагающих различные пути, частоту и дозы введения токсина в организм. В силу этого имеющиеся в литературе данные трудно сопоставлять. Нами в качестве модели экспериментального гепатита был избран метод, описаный A. Watanabe et al. ?409?. Сущность данного метода заключается в однократном внутрижелудочном введении ССl4 .Дозировка его составляет 5 мл/кг массы животного в виде 50 % оливкомасляного раствора. Этот метод позволял получать достоверные и стабильные изменения основных показателей функционального состояния организма, характеризующих поражения печени. Согласно задачам нашего исследования - изучение иммуномодулирующего действия гепатопротекторов, этот метод представлялся наиболее целесообразным, так как вызывал поражение печени в ранние сроки с момента введения токсина в организм и была возможность чётко отследить динамику изменения иммунореактивности.
В эксперименте изучали иммуномодулирующее действие гепатопротектора гептрала (Knoll, Germany) и БАВ МИГУ-1 (соединение германия с никотиновой кислотой), синтезированного на кафедре общей химии и полимеров ОНУ им. И.И. Мечникова ?245?. Выбор доз введения для препарата гептрал осуществлялся на основании данных литературы о токсичности и терапевтической эффективности ?2, 70, 73, 85, 125, 259?. Дозировки составили 20, 40 и 80 мг/кг массы животного, препарат растворяли в фирменном растворителе непосредственно перед применением. Дозы введения БАВ МИГУ-1 расчитывались на основании предварительного изучения токсичности ?66-68, 257? и составили 10 мг/кг-терапевтическая доза (1/135 ЛД50), 74мг/кг и 174 мг/кг (1/10 ЛД50). В качестве препарата сравнения, как стандартное гепатозащитное средство, использовали эссенциале, иммуномодулирующие свойства которого изучались ?108, 141, 249, 263, 265, 268, 269?. Нами взята дозировка, использованная в этих работах - 80 мг/кг массы животного. Все препараты вводились внутрибрюшинно, один раз в сутки в течение семи дней в одно и тоже время. Препараты вводили интактным и иммунизированным животным для изучения чистого иммуномодулирующего эффекта, животным с токсическим гепатитом, введение начинали с момента затравки.
Иммунизацию животных проводили внутрибрюшным введением 0,5 мл 50 % взвеси ЭБ (эритроцитов барана) отмытых 3-х кратно в физиологическом растворе. Использование этого антигена является общепринятым в исследованиях по иммунологии ?112, 113, 115?. Контрольной группе (интактные животные) вводили по 0,5 мл 0,9 % физиологического раствора.
2.2. Структура эксперимента и материал использованный в работе
Эксперимент проведен на 995 взрослых крысах обоего пола линии "Вистар", весом 180-250 г. Животные содержались в условиях вивария, в отдельных клетках на полноценном разнообразном рационе питания, включавшем свежие овощи, зерновые, хлеб, мясные отходы. Доступ к пище и воде был свободным. Работу с лабораторными животными проводили в условиях соблюдения общепринятых нормативных и биоэтических требований ?151, 157?.
Соответственно поставленным задачам были сформированы 34 группы животных представленные в таблице 2.1.
Таблица 2.1
Экспериментальные группы и количество животных использованных в работе.
№ группыНазвание группыКол-во животныхАБ В1.Интактные (контроль)52.Иммунизированные53.Интактные+эссенциале 80 мг/кг54.Интактные+гептрал 20 мг/кг55.Интактные+гептрал 40 мг/кг56.Интактные+гептрал 80 мг/кг57.Интактные+МИГУ-1 10 мг/кг58.Интактные+МИГУ-1 74 мг/кг59.Интактные+МИГУ-1 147 мг/кг510.Иммун.+эссенциале 80 мг/кг (имм. на фоне введения)511.Иммун.+гептрал 20 мг/кг (имм. на фоне введения)512.Иммун.+гептрал 40 мг/кг (имм. на фоне введения)513.Иммун.+гептрал 80 мг/кг (имм. на фоне введения)514.Иммун.+МИГУ-1 10 мг/кг (имм. на фоне введения)515.Иммун.+МИГУ-1 74 мг/кг (имм. на фоне введения)516.Иммун.+МИГУ-1 147 мг/кг (имм. на фоне введения)517.Иммун.+эссенциале 80 мг/кг (имм. после введения)518.Иммун.+гептрал 20 мг/кг (имм. после введения)519.Иммун.+гептрал 40 мг/кг (имм. после введения)5Продолжение таблицы 2.1
АБ В20.Иммун.+гептрал 80 мг/кг (имм. после введения)521.Иммун.+МИГУ-1 10 мг/кг (имм. после введения)522.Иммун.+МИГУ-1 74 мг/кг (имм. после введения)523.Иммун.+МИГУ-1 147 мг/кг (имм. после введения)524.Гепатит8025.Гепатит+иммун. (имм. до введения CCl4)8026.Гепатит+иммун. (имм. одновременно с введением CCl4)8027.Гепатит+эссенциале 80 мг/кг8028.Гепатит+гептрал 20 мг/кг8029.Гепатит+гептрал 40 мг/кг8030.Гепатит+МИГУ-1 10 мг/кг8031.