РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Виходячи з мети та задач, які поставлені в роботі, були використані фармакологічні, токсикологічні, вірусологічні, біохімічні, імунологічні та мікробіологічні методи.
2.1. Матеріали дослідження.
Віруси. В роботі використані віруси:
- грипу А/Гонконг/1/68/Н3N2. Пасували розведенням в алантоїсній порожнині 10-11- добових курячих ембріонів по методиці [173]. Інфекційний титр алантоїсної культури вірусу дорівнював 8,0 lg ЕІД50 / 0,2 мл, титр гемаглютинінів 1:256 ГАО/0,2 мл; інфекційний титр суспензії легеневої тканини мишей - 5,0 lg ТЦД50, гемаглютининів 1:320 ГАО /0,2 мл;
- вірус герпесу простого 1 антигенного типу, штам VС з інфекційним титром по ЦПД50 в культурі клітин VERO 7,0 lg/0,1 мл; при інтрацеребральному зараженні білих нелінейних мишей - 4,0 lg ЛД50 /0,03 мл;
- вірус везикулярного стоматиту (ВВС) - штам Індіана. Інфекційний титр в культурі тканин Л-41 становив 4,0 lg ЦПД50 /0,1 мл.
Віруси грипу, герпесу та везикулярного стоматиту одержані з музею вірусів Інституту вірусології РАМН (Москва).
Культури клітин:
- Л-41- лімфобластоідні клітини людини, висівна доза -200 000 клітин в 1 мл живильного середовища;
- VERO-клітини нирки зеленої мавпи, висівна доза 2-3?105 /мл.
Для моношарового культивування клітин використовували середовище 199 з 10% сироваткою крові теляти, 1% глютаміну та гентаміцину (100 мкг/мл). В якості підтримуючого використовували середовище 199 та 2% сироватки крові.
Бактерії та гриби.
В роботі використані такі штами мікроорганізмів :
Staphylococcus aureus - АТСС 25923, Еscherichia соli - АТСС 25922, Рseudomonas aeruginosa - АТСC 27853 та Сandida albicans -NCTC 885?653 (Лондон), отримані з Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського.
Лабораторні тварини
Білі нелінійні миші, білі щури лінії Вістар. Курячі ембріони.
Таблиця 2.1
Кількість тварин, використаних в роботі
Вид тваринКількістьХарактер дослідженьМиші білі нелінійні
Щури білі лінії Вістар
Курячі ембріони250
203
240
80
200
112
Гостра токсичність
Вивчення специфічної дії
Вивчення впливу на імунну систему
Гостра токсичність
Токсичність
Антивірусна дія
Всього в роботі використано 693 білі мишій, 80 білих щурів та 312 курячих ембріонів.
Речовини. В роботі досліджували вперше синтезовані сполуки каркасної будови, похідні адамантану та норборнану.
Для дослідження використані препарати - віролекс, виробництва
фірми КRКA Novo Mesto (Словенія), а також ремантадин виробництва АТ " Олайнфарм" (Латвія).
2.2 Методи дослідження.
2.2.1.Токсикологічні дослідження
Визначення гострої токсичності сполук на тваринах проводили за методом [174 ], in vitro - за [175,176 ], in ovo визначали за методом [ 177,178 ].
2.2.2.Вірусологічні дослідження
Цитотоксичну дію синтезованих сполук в культурі клітин визначали за дією на моношар клітин VERO за методом [176, 179 ] з встановленням максимально переносимої концентрації речовини (МПК), як такої, що не спричиняє незворотніх змін у морфології та життєздатності клітин.
Для оцінки ефективності речовини в культурі клітин і доцільності подальшого вивчення in vivo визначали хіміотерапевтичний індекс (ХТІ), як відношення МПК до мінімально активної концентрації (МАК). МАК - мінімальна кількість речовини, що гальмує розвиток специфічної цитопатичної дії (ЦПД) ВГП-1 типу на 50% [175, 179 ].
Антивірусну активність речовин вивчали також в реакції нейтралізації цитопатичної дії вірусу в культурі клітин VERO ( нирки зеленої мавпи), в основі якої лежить здатність антивірусних сполук пригнічувати інфекційні властивості вірусу [ 176, 178 ].
Вплив синтезованих сполук на репродукцію вірусу грипу визначали in ovo за різницею інфекційних титрів в досліді та в контролі, а також за титром гемаглютининів в реакції гемаглютинації [177 ].
Механізм вірусінгібуючої дії сполук вивчали за впливом на ферменти репродукції вірусів, а саме активність ДНК-полімерази [180, 181, 185] та тимідинкінази [ 182, 183], а також за здатністю індукувати синтез інтерферону [ 175 ].
Тестування на ДНК-полімеразну активність проводили in vitro в системі, яка вміщує субстрати дезокситрифосфатнуклеотиди (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), один з них (дТТФ) мав мічений по тритію тимідин. Як "затравку" синтезу нуклеїнової кислоти використовували матрицю - активовану ДНК тимусу теляти. Ферментним препаратом слугувала ДНК-полімераза, виділена з гомогенату клітин мозку мишей, інфікованих ВПГ-1, та ДНК- полімераза, виділена з клітин ціанобактерії Plectonema borianum. Досліджувану сполуку вносили в концентрації від 1 до100 мкг/мл. Виділення та очистку ДНК-полімеразу клітин ціанобактерії Plectonema borianum проводили шляхом механічного руйнування клітин на гомогенізаторі Л-17 за допомогою кварцевого піску, екстрагування ферменту буфером з КСl в присутності детергента, преципітації фермент-нуклеїнового комплексу поліетиленгліколем та препаративного електрофорезу з подальшою електроелюцією білків з геля. Реакцію полімеризації зупиняли 400 мкл 10% трихлороцтової кислоти, радіоактивний продукт осаджували на фильтрах GF/C за методом Bollum [180]. Інтенсивність включення мітки вимірювали в лічильнику радіоактивності " Beckman LS 7800", використовуючи сцинтилятор ЖС-8.
Визначення тимідинкіназної активності проводили за [183 ]. Реакційна суміш складалась з С14-тимідину, АТФ, MgCl2, меркаптоетанолу, тріс -HСl, (рН 8,0) та ферментного препарату тимідинкінази, виділеної з клітин мозку тварин, інфікованих ВПГ-1 та тимідинкінази, виділеної з клітин мозку інтактних тварин.
Відсоток перетвореного С14-тимідина розраховували по формулі:
кількість імпульсів/хв оброблених етанолом фільтрів
---------------------------