РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження фармакокінетики і фармакодинаміки протисудомних сполук було проведено з використанням похідних 1,4 - бенздіазепіну: феназепама, 3-оксифеназепама, гідазепама, циназепама та 7-бром-5-феніл-1,2-дігідро-3H-1,4-бенздіазепін-2-ону (БД-3), ), а також їх радіоактивних, мічених по 14С аналогів: 14С- феназепама, 14С- 3-оксифеназепама, 14С- гідазепама, 14С-циназепама з питомою активністю 0,27 Сu/mole; 0,5 Сu/mole; 0,70 Сu/mole та 0,3 Cu/mole відповідно, синтезованих у ПНДЛ-5 Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова й у Фізико-хімічному інституті ім. О. В. Богатського НАН України; зворотних агоністів: бікукуліну ("Sigma"), коразолу, тіосемікарбазиду ("Реахим"), стрихніну ("Acros").
Методи синтезу, докази хімічної будови сполук фізико-хімічними методами (УФ-, ЯМР- спектроскопії, мас-спектроскопії й ін.), були викладені в роботах [148, 149].
У ході науково - дослідних робіт також використовувалися: твін-80, тритон Х-100, 2,5-діфенілоксазол (POPOP), 1,4-біс-2-(5-феніл)- оксазолілбензол (PPO) і рідкі сцинтиляційні суміші фірми "СANBERA PACARD". Інші реактиви виробництва фірми "Реахим" вітчизняного виробництва марки ч.д.а та о.с.ч.
Досліди були проведені на нелінійних мишах масою 18-25 г та щурах лінії "Вістар" масою 180-280 г. Експериментальні тварини утримувалися на повноцінній лабораторній дієті при природному світловому циклі. Досліджувані водорозчинні сполуки вводили в ізотонічному розчині NaCl, ліпофільні - у твиновій суспензії. Були використані внутрішньочеревинний, внутрішньосудинний способи введення речовин експериментальним тваринам. Похідні 1,4-бенздіазепіну вводилися в дозах 0,085 - 28 мг/кг. Вибір доз цих препаратів обумовлений раніше проведеними дослідженнями їх протисудомної активності як при внутрішньосудинній інфузії зворотних агоністів ГАМК- медіаторної системи, так і на моделі осередкової епілепсії, викликаної аплікацією бікукуліну, коразолу пікротоксину, пеніциліну [29, 69, 145, 153, 184], що дає можливість провести порівняльний аналіз дії проліків і ліків при різних умовах, що модулюють, гальмівні медіаторні системи.
Контрольним тваринам уводилися відповідні об'єми фізіологічного розчину або твинової суспензії.
2.1. Методи дослідження транквілізуючої активності
За тестом обертового стержня оцінювали порушення координації рухів і рівноваги піддослідних тварин[148]. На горизонтальний стержень діаметром 2 см і швидкістю обертань 5 об/хв поміщали мишей. Контрольну і дослідні групи по 10 експериментальних тварин відбирали по їхній здатності утримувати рівновагу на стрижні протягом 2 хв. Дослідним групам мишей уводили внутрішньочеревинно циназепам у дозах 0,5 - 5 мг/кг за 30 хв до оцінки ефектів міорелаксації. Нездатність тварин утримувати рівновагу на стержні протягом 2 хв під впливом речовин розглядали як прояв порушень координації рухів. Оцінювався час настання і припинення досліджуваних ефектів.
За методикою "відкритого поля", досліджуючи рухово-дослідницьку орієнтаційну поведінку нелінійних мишей оцінювали здатність циназепамау гнітити орієнтовані реакції експериментальних тварин [148].
Експериментальним тваринам (групи по 15 мишей) внутрішньочеревинно вводили циназепам у дозах 0,05 і 0,1 мг/кг за 30 хв до початку експерименту. Перед переміщенням у "відкрите поле" тварин витримували в темній камері 1 хв. Потім тварин поміщали в поле, де протягом п'яти хвилин реєструвалися кількість пересічених квадратів на периферії (періодична активність), у центрі (центральна активність) і число стійок (вертикальна).
За методом максимального електрошоку (МЕШ) визначали протисудомну активність на 96 білих безпородних мишах, масою 18-25 г. Усі тварини були поділені на групи, кожну з яких входило по 12 мишей. Контрольній групі уводився фізіологічний розчин в об'ємі, еквівалентному об'ємові дози циназепаму (0,01 мл/г маси тіла тварини). Дослідним групам уводився внутрішньочеревинно циназепам у твиновій емульсії за 30 хв до оцінки протисудомного ефекту в дозах 2 - 16 мг/кг. Протисудомну активність циназепама оцінювали по попередженню максимального електросудомного нападу у мишей, що одержують пропущенням через голову мишей, за допомогою корнеальних електродів перемінного струму частотою 50 Гц, силоміць 50 мА і тривалістю 0,2 сек, що є достатнім для виклику судорог у миші [150].
Далі тварина поміщалася на стіл або в прозорий контейнер і перебувала під спостереженням. Під дією струму відбувається тонічне скорочення задніх кінцівок. Через 10 - 15 сек тонічна фаза поступово переходить у клонічну. На тонічне скорочення часто нашаровується дрібний високочастотний тремор. Миша вважається не захищеної, якщо тонічні і клонічні судоми спостерігаються, протягом 10 сек і більш, якщо в проміжку меншому, ніж 10 сек, судороги відсутні, миша вважається захищеної дією препарату. Враховується кількість мишей захищених у кожній групі в процентнім вираженні від загального числа випробуваних тварин.
В коразоловому тесті визначення протисудомної активності циназепаму [148] проводилося на 60 нелінійних білих мишах вагою 18 - 25 г, розподілених на групи по 6 тварин. Експериментальним тваринам внутрішньочеревинно вводили циназепам у дозах 0,01 - 0,16 мг/кг за 30 хв до підшкірного введення коразолу в дозі, що викликає 95% cудомний напад у мишей (125 мг/кг). Реєстрацію клоніко - тонічних судом і тонічну екстензію здійснювали протягом години.
Електрофізіологічний метод дослідження протисудомної дії похідних 1,4 - бенздіазепінів здійснювали в умовах гострого експерименту на 147 щурах лінії Вистар вагою 180 - 280 г. Всі підготовчі операції фіксація тварин у стереотаксичному апараті, видалення м'яких тканин дорсальної поверхні черепа, трепанація черепа, розкриття твердої мозкової оболонки, постановка коркових електродів, робили під ефірним наркозом. Досліди починали через 1 - 1,5 годину після припинення інгаляції ефіру.
Для створення детерміна