ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Экспериментальные животные
Исследования проведены на 106 самцах и 86 самках крыс линии Вистар с датируемым сроком рождения. Потомство этих животных получали от самок крыс, полученных из питомника ООО "Биомодельсервис" (Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, г.Киев). Для получения потомства отбирались самки крыс массой 250-270 г, с устойчивым эстральным циклом, который устанавливали согласно "Методическим рекомендациям" Фармакологического центра при МЗ Украины [165]. Животные находились в виварии (Т=18-22oC) в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище.
2.2. Серии экспериментальных исследований
Экспериментальные группы животных формировались из потомства, полученного от беременных самок, которые с 15 дня датированной беременности и вплоть до родов подвергались ежедневной 1-часовой жесткой иммобилизации [165]. При этом их потомство испытывало так называемый пренатальный стресс [1, 5, 6, 8]. У самцов и самок пренатально стрессированных крыс изучали функциональное состояние панкреатических островков в возрасте 1 сутки, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца и 5 месяцев. Контролем служили животные того же возраста и пола, полученные от самок крыс с нормальным протеканием беременности.
Животным обоего пола в возрасте 1 и 5 месяцев проводили тест толерантности к глюкозе. У самцов крыс этих же возрастных групп определяли резистентность ?-клеток поджелудочной железы к действию ?-цитотоксического антибиотика стрептозотоцина.
Распределение животных в экспериментальных группах представлено в таблице 2.1.
Таблица 2.1
Распределение крыс в экспериментальных сериях
Серии исследованийВозраст животныхКоличество животныхсамцысамкиПренатальный стресс1 сутки55 2 недели55 1 месяц55 3 месяца55 5 месяцев55 Контроль1 сутки55 2 недели55 1 месяц55 3 месяца55 5 месяцев55 Тест толерантности к глюкозеПренатальный стресс, 1 месяц99 Контроль, 1 месяц99 Пренатальный стресс, 5 месяцев99 Контроль, 5 месяцев99 Резистентность ?-клеток к повреждающему действию стрептозотоцинаПренатальный стресс, 1 месяц5- Контроль, 1 месяц5- Пренатальный стресс, 5 месяцев5- Контроль, 5 месяцев5-
2.3. Метод подготовки поджелудочной железы для гистологического исследования
В указанные возрастные сроки исследований животных умерщвляли одномоментной декапитацией. За 12 часов до забоя животных лишали пищи, за исключением новорожденных крыс. Поджелудочную железу извлекали и помещали в фиксатор Буэна на 20 часов при комнатной температуре. После стандартной процедуры обезвоживания и пропитки хлороформом и парафином, железу заливали в парафин. На ротационном микроскопе готовили серийные срезы из различных участков поджелудочной железы толщиной 4 мкм. Перед проведением гистохимического или иммунофлюоресцентного окрашивания отобранные гистологические срезы депарафинировали в ксилоле, проводили регидратацию в нисходящих концентрациях этанола (100%, 96%, 70%) и трижды по 10 минут отмывали в 0,1 М фосфатном буфере (pH=7,2).
2.4. Методика идентификации ?-клеток в панкреатических островках
Для идентификации ?-клеток в поджелудочной железе применяли наборы для иммунофлюоресцентного выявления инсулина в тканях производства фирмы Peninsula Laboratories Inc. (США). Для исследования отбирали гистологические срезы из различных участков поджелудочной железы. Предварительно, для демаскирования поверхностных клеточных антигенов, отмытые в 0,1 М фосфатном буфере срезы железы в течении 45 минут (Т=37оС) инкубировали с 0,1% раствором трипсина, разведенным 0,1% раствором CaCl2, и затем дважды отмывали в 0,1 М фосфатном буфере (pH=7,4). После этого срезы в течении 30 минут (Т=37оС) инкубировали с нормальной козьей сывороткой (разведение 1:10), и затем с первичными антителами к инсулину (разведение 1:200) в течении 16 часов при Т=4оС. После отмывки избытка первичных антител в 0,1 М фосфатном буфере, срезы инкубировали 60 минут (Т=37оС) со вторичными антителами, конъюгированными с FITC (разведение 1:100). После инкубации срезы промывали 0,1 М фосфатным буфером и заключали в смесь глицерина и фосфатного буфера (9:1) для последующей флюоресцентной микроскопии.
Для контроля специфичности связывания антител проводили аналогичные процедуры окрашивания, за исключением инкубации с первичными антителами к инсулину.
2.5. Методика идентификации ?-клеток в панкреатических островках
Для идентификации ?-клеток в панкреатических островках отмытые в 0,1 М фосфатном буфере срезы железы инкубировали с первичными антителами, в качестве которых использовали мышиные моноклональные антитела к глюкагону (SIGMA Chemical, США), которые в разведении 1:2000 инкубировали в течении 16 часов при Т=4оС. Затем, после трехкратной отмывки в 0,1 М фосфатном буфере, срезы инкубировали со вторичными антителами, в качестве которых использовали кроличьи антитела против IgG мыши, конъюгированные с FITC (SIGMA Chemical, США) в разведении 1:64 при Т=37оС в течение 60 минут. После инкубации срезы промывали 0,1 М фосфатным буфером и заключали в смесь глицерина и фосфатного буфера (9:1) для последующей флюоресцентной микроскопии.
Для контроля специфичности связывания антител проводили аналогичные процедуры окрашивания, за исключением инкубации с первичными антителами к глюкагону.
2.6. Методика количественного анализа иммунофлюоресцентной реакции
Панкреатические островки, содержащие ?- или ?-клетки изучали в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390 нм на компьютерной системе цифрового анализа изображения VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Германия) Изображение, получаемое на микроскопе AXIOSKOP (ZEISS, Германия) в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390 нм, с помощью высокочувствительной видеокамеры COHU-4722 (COHU Inc., США) немедленно вводилось в компьютерную систему цифрового анализа изображения VIDAS-386. При этом исключался эффект "выгоран
- Київ+380960830922