РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛИ
ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Вибір напрямів досліджень
Оскільки, при циноглосотоксикозі не вивчено ранні симптоми і не розроблені методи діагностики, ми поставили за мету з'ясувати патогенез, узагальнити методи діагностики та систематизувати профілактичні заходи при отруєнні тварин чорнокоренем лікарським.
Для виконання цих завдань ми обрали наступні напрями роботи.
На першому етапі роботи здійснено біопробу на телятах у січні 1997 р. у колгоспі "8 Березня" Тульчинського району Вінницької області (рис. 2.1).
На другому етапі роботи досліджували стан хворих на циноглосоафлатоксикоз коней у 1997 р. на Деркульському кінному заводі № 63 (Луганська область). На перших двох етапах проведені клінічні дослідження, біохімічний аналіз та дослідження морфологічного складу крові, відібрано матеріал для патолого-гістологічних досліджень, а при вивчені хронічного циноглосоафлатоксикозу проведені також фізико-хімічні дослідження сечі.
На третьому етапі роботи відтворено гострий і хронічний перебіг циноглосотоксикозу у мишей та щурів, виявлено дію різних кількостей настойки чорнокореня на їх організм, встановлено абсолютно смертельну і середньо смертельну дози спиртової настойки чорнокореня для мишей, досліджено характер патолого-гістологічних змін за різних шляхів уведення та гострого і хронічного отруєння.
На четвертому етапі проведені гістологічні дослідження та проаналізовані їх результати.
На п'ятому етапі узагальнено методи діагностики та систематизовані профілактичні заходи.
Вивчення токсичності чорнокореня лікарського
Рис 2. 1 Схема виконання дослідів на тваринах та методи досліджень при вивченні токсикології чорнокореня лікарського
2.2. Матеріали і методи досліджень
Дослідженню підлягав чорнокорінь лікарський, який збирали у Тульчинському і Вінницькому районах Вінницької та Тетіївському районі Київської області у травні - червні 1996 - 1997 рр. та 2001 - 2002 рр.
У дослідах використовували борошно, сухе листя, сіно, настій та настойку з надземних частин чорнокореня лікарського другого року вегетації.
Зібрані рослини висушували у затінку і зберігали в сухому місці у закритій тарі. Для виготовлення настою рослинну сировину заливали водою у співвідношенні 1:10, витримували на водяній бані 15 хв, фільтрували через 45 хвилин. Настойку чорнокореня виготовляли за загальноприйнятою методикою шляхом настоювання трави та насіння на 70?-му етиловому спирті у співвідношенні 1:10 протягом 7 діб. Перед уведенням настойку розводили дистильованою водою у співвідношенні 1:1 [34,143]. Борошно з трави чорнокореня виготовляли за допомогою лабораторного електричного млина.
Матеріалом для лабораторних досліджень слугували проби крові, сечі, органи та патматеріал від вимушено забитих та загиблих коней, телят, мишей і щурів, які досліджували у лабораторіях кафедри фармакології та токсикології і кафедри патологічної анатомії НАУ з січня 1997 по листопад 2004 р.
При вивченні гострих і хронічних отруєнь тварин чорнокоренем лікарським проводили клінічні, морфологічні, біохімічні, патолого-анатомічні, гістологічні і хіміко-токсикологічні дослідження. При клінічному обстеженні тварин під час проведення біопроби у телят вивчали загальний стан організму, досліджували окремі системи загальноприйнятими методами [74].
Підрахунок формених елементів крові (еритроцитів, лейкоцитів) здійснювали пробірковим методом у камері з сіткою Горєва, гемоглобін визначали колориметричним методом (Меньшиков В.В, 1987) [88]. Лейкограму крові визначали на підставі підрахунку 100 клітин у зафарбованому мазку за Романовським-Гімзою, гематокритну величину - мікрометодом у модифікації Й. Тодорова (1979) [75]. Вміст гемоглобіну в еритроциті (ВГЕ) і середній об'єм еритроцита (СОЕ) підраховували математично [74].
Біохімічні дослідження включали визначення:
а) у безбілковому фільтраті крові концентрації сечовини з використанням диметилгліоксиму [134]; глюкози - за допомогою антро-нового реактиву [16]; піровиноградної кислоти за реакцією з 2,4 динітрофеніл-гідразином [16];
б) у сироватці крові - білка за біуретовою реакцією [11].
У сечі конематок визначали за допомогою тест - наборів "Combina" 9 SG (вир. Німеччина) відносну густину, величину pН, наявність еритроцитів, вміст білка, гемоглобіну, нітритів, глюкози, уробіліногену, білірубіну, кетонових тіл.
Для визначення ЛД50 використали метод найменших квадратів за В.Б. Прозоровським [145,146] .
Результати досліджень оброблені статистично. Вірогідність різниць між середньоарифметичними даними визначали за критерієм Стьюдента. Вірогідними вважали різницю, при якій р ?0,05 [101].
2.3. Методики досліджень
Підготовка матеріалу для патолого-гістологічних досліджень.
Для патолого-гістологічного дослідження матеріал відбирали у вимушено забитих та загиблих телят, коней, мишей та щурів. Відібраний матеріал фіксували у 10% - му нейтральному розчині формаліну за прописом Ліллі протягом 3-5 діб при +4 ?С. Після цього шматочки 24 години промивали у проточній воді для видалення надлишку фіксатора і зневоднювали у серії етанолу зростаючої міцності (60?, 70?, 80?, 96?, 100?), витримуючи у кожній порції по 24 години. Абсолютний етанол одержували шляхом витримування 96?-ного етанолу над зневодженим мідним купоросом. Зневоднені шматочки через ксилол заливали у парафін. Серійні зрізи товщиною 7-10 мкм одержували за допомогою санного мікротома. Для вивчення гістологічної будови органів зрізи фарбували гематоксиліном Караці і еозином. Для цього їх депарафінували у розчині ксилолу, потім через 100?-ний і 70?-ний етанол доводили до води, фарбували гематоксиліном Караці і переносили у водопровідну воду, де зрізи набували інтенсивно синього кольору. Потім їх фарбували еозином, зневоднювали у 70?-ному і 100?-ному етанолах, проводили через карбол-ксилол, просвітлювали у чистому ксилолі і пере