РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Умови та програма проведення досліджень. Ми звертали особливу увагу на забезпечення інтактного стану тварин, оскільки навіть звичайні маніпуляції з ними (відкривання клітки, де містяться тварини, перенесення із віварію в лабораторну кімнату тощо) можуть істотно впливати на різні функціональні показники клітинного дихання. Тварини (білі щурі лінії Вістар та мурчаки) утримувались у стаціонарних умовах віварію при постійній температурі та природному освітленні. Дослідження проведені на щурах-самцях масою 0,18-0,20 кг та мурчаках масою 0,40-0,45 кг. Тварин перед дослідом переносили у лабораторне приміщення для звикання до нових умов. Досліди проводили в однакові години доби для виключення впливу на результати коливань добових ритмів.
Ін'єкцію препаратів і декапітацію тварин проводили швидко. Візуально контролювали поведінку тварин. Із бокса щурів виймали за хвіст без корнцанга. Ін'єкцію та декапітацію здійснювали в іншій кімнаті, ізольовано від решти тварин. Час від декапітації до охолодження органу становив 10-15 с. Експерименти з лабораторними тваринами проводили з дотриманням вимог "Європейської конвенції захисту тварин, які використовуються з експериментальними та іншими цілями" (Страсбург, 18.03.1986), наказ МОЗ УССР № 32 від 22.02.1988 р.
Експериментальні дослідження включали такі основні етапи:
1. Дослідження впливу модуляторів КATФ-каналів на функціонування мітохондрій (АДФ-стимульоване дихання, кальцієва ємність) печінки та міокарда, інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів та активність ферментів антиоксидантного захисту у крові, печінці та міокарді щурів із різною резистентністю до гіпоксії.
2. Вивчення ефектів модуляторів КATФ-каналів на процеси енергозабезпечення у печінці та міокарді, інтенсивність процесів ліпопероксидації та стан системи антиоксидантного захисту у крові, печінці та міокарді щурів із різною резистентністю до гіпоксії за стресу.
3. Оцінка функціонального стану мітохондрій печінки та міокарда, системи антиоксидантного захисту та інтенсивності процесів ПОЛ за введення модуляторів КАТФ-каналів за моделі адреналінової міокардіодистрофії у щурів із різною резистентністю до гіпоксії та мурчаків.
4. Дослідження впливу модуляторів КАТФ-каналів та інтервальної гіпоксії на функціонування мітохондрій печінки та процеси ліпопероксидації за стресу.
Дослідження виконували на щурах, яких розділили на групи із високою і низькою резистентністю до гіпоксії за методом В.Я. Березовського (1975). Величину реакції тварин на гостру гіпоксію оцінювали за часом їх перебування на "висоті" 12 000 м ("підйом" у барокамері) до появи другого агонального вдоху або судом [10]. У ВР тварин він складав 7 хвилин і більше, у НР - до 2 хв. Після 14 діб адаптації тваринам вводили внутрішньоочеревинно у кількості 1 мл: фізіологічний розчин, активатори КАТФ-каналів пінацидил (0,06 мг/кг, "Sigma", США), діазоксид (1 мг/кг, "Sigma", США) або блокатори глібенкламід (1 мг/кг, "Sigma", США), 5-гідроксидеканоат (5 мг/кг, "Sigma", США). Час дії препаратів складав 30 хв, після чого тварин декапітували під ефірним наркозом.
Окремі серії досліджень виконували на тваринах із високою і низькою резистентністю до гіпоксії за умов стресу. Для цього щурів поміщали у закриту сіткою клітку, де відстань від води до сітки становила 5 см згідно методу, запропонованого О.Н. Бондаренком і співавт. [15]. Час перебування тварин за таких умов становив 30 хв. Перед дослідом кожній групі тварин вводили 1 мл активатора або блокатора КАТФ-каналів у зазначених дозах.
З метою моделювання експериментальної адреналінової міокардіодистрофії (АМД) тваринам одноразово внутрішньом'язово вводили 0,1% розчин адреналіну гідрохлориду (1,5 мг/кг). Відомо, що найпомітніші морфологічні і біохімічні зміни проявляються упродовж першої доби після введення великих доз адреналіну, тому з метою виявлення максимальних порушень енергетичного метаболізму ми вивчали процеси АДФ-стимульованого дихання у мітохондріях на 24 годину від початку експерименту [86, 87]. Для дослідження впливу модуляторів КАТФ-каналів їх вводили дослідним тваринам внутрішньоочеревинно за 30 хв до введення адреналіну.
Інші групи тварин використовували у досліді після курсу 14-денних інтервальних гіпоксичних тренувань (ІГТ). Кожного дня тварин поміщали в камеру, яку почергово впродовж 15-хвилинних інтервалів вентилювали газовою сумішшю з 10% кисню в азоті та кімнатним повітрям. Кількість таких циклів становила 5 на день. На наступну добу після останнього курсу ІГТ дослідним тваринам вводили модулятори КАТФ-каналів внутрішньоочеревинно за 30 хв до стресу.
2.2. Виділення мітохондрій печінки і міокарда щурів й мурчаків. Мітохондрії (МХ) печінки виділяли методом диференційного центрифугування за схемою досліду, що дозволяє зберігати нативність ізольованих органел [59, 196]. Видалений з декапітованих тварин орган поміщали у льодяне середовище гомогенізації (-20С). Охолоджену тканину подрібнювали, пропускаючи через прес, і гомогенізували в гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при швидкості обертів 300/хв і 3 вертикальних ходах товкачика. Середовище гомогенізації для печінки містило (в ммоль/л): KCl - 120, K2CO3 - 2, HEPES - 10, EGTA - 1 (pH 7,2). З 8%-го гомогенату центрифугуванням поетапно осаджували фракцію ядер: 3 хв при 150 g і 4 хв при 300 g без зупинки центрифуги. Мітохондріальну фракцію отримували центрифугуванням надосадової рідини протягом 10 хв при 4500 g. Отриманий осад регомогенізували вручну (один вертикальний хід товкачика) з середовищем гомогенізації, яке додавали з розрахунку отримання суспензії МХ печінки з концентрацією 70-90 мг мітохондріального білка в 1 мл. Концентрацію білка вимірювали за Лоурі [208]. Середовище інкубації для МХ печінки містило (у ммоль/л): KCl - 120, K2CO3 - 2, KH2PO4 - 2, HEPES - 10 (pH 7,2).
Мітохондрії міокарда виділяли методом диференційного центрифугування. Середовище виділення містило (в ммоль/л): KCl - 180, 0,5% бичачий сирова