РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМКІВ ДОСЛІДЖЕНЬ
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дисертаційна робота присвячена вивченню органів ендокринної системи в ланцюгу гіпофіз-наднирники-яєчники у клінічно здорової великої рогатої худоби (n = 30) чорно-рябої породи, вирощеної в колективних господарствах та індивідуальному секторі Овруцького району Житомирської області. Згідно Постанови Кабінету Міністрів України за №106 від 23 липня 1991 року територія цих господарств відноситься до третьої зони радіоактивного забруднення.
Дослідження проводились впродовж 2001-2004 років на кафедрі анатомії і гістології факультету ветеринарної медицини Державного агроекологічного університету, в радіологічному відділі Житомирської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини.
Вивчення вікових змін в органах ендокринної системи великої рогатої худоби, вирощеної в умовах постійного впливу малих доз радіації, проводилось у трьох вікових групах:
I група - ВРХ 6-ти місячного віку (n = 10);
II група - ВРХ однорічного віку (n = 10);
III група - ВРХ 3-4-х річного віку (n = 10).
Для контролю була використана велика рогата худоба (n = 30) аналогічного віку та породи з благополучних щодо інфекційних хвороба господарств Романівського району Житомирської області, де рівень радіації був у межах природних фонових величин.
Матеріал для дослідження відбирали під час забою тварин на Овруцькому забійному пункті, для контролю - на Житомирському м'ясокомбінаті.
У господарствах, з яких походили дослідні тварини, проводили радіологічні дослідження. При цьому гамма-фон на території господарств (у тому числі у стійлових приміщеннях, на вигульних майданчиках і пасовищах) визначали гамма-радіометром СРП 68-01. Дані про щільність забруднення ґрунтів, а також про ступінь забруднення згодовуваних кормів радіонуклідами використані зі звітних матеріалів Житомирської державної лабораторії ветеринарної медицини.
Перед забоєм тварин вимірювали їх прижиттєвий рівень радіоактивності гамма-радіометром СРП 68-01 в ділянці лопатки. Вміст радіоактивного цезію в м'язах і паренхіматозних органах визначали за допомогою гамма-радіометрів РУБ-01 П6 та РУГ-91 "Адоні".
Для гістологічного, гістохімічного та морфометричного досліджень відбирали гіпофіз, наднирники та яєчники (табл. 2.1).
Таблиця 2.1.
Характеристика методів та кількості досліджень у дослідних та контрольних тварин
Методи дослідженняДосліджуваний матеріалКількість голівКонтрольДослідРазом1. Анатомічні (препарування)
Гіпофіз, надниркові залози, яєчники.
30
30
602. Гістологічні:а) фарбування гематоксиліном та еозиномГіпофіз, надниркові залози, яєчники.
30
30
60
б) фарбування за Ван-ГізонГіпофіз, надниркові залози, яєчники.
10
10
203. Гістохімічні:а) виявлення нуклеїнових кислот за ЕйнарсономГіпофіз, надниркові залози, яєчники.
10б) виявлення нуклеїнових кислот за БрашеГіпофіз, надниркові залози, яєчники.
12в)виявлення сумарних білків за ШустомГіпофіз, надниркові залози, яєчники6612г) виявлення основних і кислих білків за Мікель-КальвоГіпофіз, надниркові залози, яєчники.
10е) виявлення ліпідів за Мак-МанусомГіпофіз, надниркові залози, яєчники.
12ж) виявлення ліпідів за КайномГіпофіз, надниркові залози, яєчники.
8з ) виявлення ліпідів за Кей-УайхедомГіпофіз, надниркові залози, яєчники.
8
Всі відібрані органи після забою зважували. В яєчниках визначали лінійні розміри: довжину, ширину, товщину за допомогою штангенциркуля.
Для гістологічних та гістохімічних досліджень шматочки матеріалу після забою тварин фіксували в 10 - 12 % - ному водному розчині нейтрального формаліну та рідині Карнуа, з послідуючою заливкою в парафін (94(. Парафінові зрізи виготовляли на санному мікротомі МС-2. Товщина зрізів не перевищувала 10 мкм.
Для вивчення морфології клітин і тканин застосовували фарбування гематоксиліном Ерліха та еозином, метод Ван-Гізон.
При гістохімічному вивченні нуклеїнових кислот і білків в якості фік-суючого засобу, звичайно, служила рідина Карнуа, а в окремих випадках 10-12 % - ний розчин нейтрального формаліну.
Виявлення нуклеїнових кислот проводили за методом Ейнарсона (1951), Браше (1942), основних і кислих білкових речовин - за Мікель - Кальво (1957), сумарних білків - за Шустом (1967) (78(.
Вміст нуклеїнових кислот визначали фарбуванням зрізів галлоціанін - хромовими галунами за Ейнарсоном. Метод Браше дозволив виявити окремо ДНК і РНК (на одному і тому ж) препараті. Вважається, що реакція метилового зеленого і піроніну з двома нуклеїновими кислотами заснована на базофілії структур і обумовлена наявністю в складі молекул ДНК та РНК залишків фосфорної кислоти (110(. При виникненні забарвлення ДНК і РНК основне місце належить явищу адсорбції, яка відбувається при структурній відповідності між аміногрупами молекул барвника і фосфорними групами полінуклеотидних ланцюгів.
Для вивчення локалізації і вмісту загальних ліпідів використовували фарбування суданом чорним В за Мак-Манусом (1946), суданом -3 - за Кей-Уайхедом (1941), кислих і нейтральних ліпідів - розчином сульфату нільського голубого за Кайном (1947). Для постановки реакцій використовували мікроскопічні зрізи відповідних ділянок органів і тканин тільки що забитих тварин. Після постановки реакції на виявлення тканьових ліпідів за Кей і Уайхедом зрізи дофарбовували гематоксиліном.
Зрізи отримували на мікротомі-кріостаті - МК-25. Заключали препарати в усіх випадках в гліцерин-желатину.
Гістохімічні препарати і контролі до них виготовлялись за методиками, викладеними в гістохімічних посібниках (78, 110(.
Гістохімічні методи дослідження дозволили вивчити основні сторони хімічної статистики і динаміки органів і тканин: розміщення і характер реакції на вміст нуклеїнових кислот, білків, ліпідів у контрольних та дослідних групах тварин.
Морфометричні дослідження ст