Розділ 2
Матеріали та методи досліджень
2.1. Об`єкти досліджень та їх культивування
Для досліджень нами використано окремі представники роду Bacillus: B. licheniformis 31, B. subtilis 3, які входять до складу пробіотика "Біоспорин" (Україна); B. cereus ДМ 423, що входить до складу біопрепарату "Цереобіоген" (Китай) та B. licheniformis 49, B. cereus 89, B. subtilis 1/2 отримані з колекції відділу антибіотиків ІМВ ім. Д.К. Заболотного НАН України; штам B.subtilis 668, отриманий з колекції відділу фізіології промислових мікроорганізмів ІМВ, виділений з шлунково-кишкового тракту щойно народженого здорового теляти. Бацили вирощували при 37 0С на качалках (160 об/хв) протягом 19-20 год на рідкому середовищі Гаузе, що містило 1% гліцерину як джерело вуглецю. Клітини збирали центрифугуванням при 8000g протягом 20 хв.
В роботі використано культури молочнокислих бактерій одержані з колекції відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України, які відносяться до різних таксономічних груп. Штам Lactobacillus plantarum 11/16 є мешканцем епіфітної мікрофлори дикорослих рослин Центральної Азії, належить до роду Lactobacillus Beijerinck і використовується у складі біоконсерванта "Літосил". Штам Enterococcus faecium K-50 був виділений з травного тракту курчат, належить до роду Enterococcus і використовується у складі пробіотичного препарату "Лактин". Два штами належать до роду Streptococcus Rosenbach - S.thermophilus S1 (неслизова раса) і S.thermophilus S5 (слизова раса), і є компонентами бактеріальної закваски "Геросан". Молочнокислі бактерії вирощували на середовищі МРС при 370С протягом 72 год [26], потім збирали центрифугуванням при 5000 g протягом 20 хв.
Об`єктами досліджень були також штами молікутів, одержані з колекції Інституту медичної мікробіології м. Орхус (Данія): Mycoplasma fermentans PG-18, Acholeplasma laidlawii PG-8 та A.laidlawii var. granulum шт.118 - фітопатогенний збудник блідо-зеленої карликовості зернових, виділений у відділі мікоплазмології ІМВ НАНУ [81]. Молікути вирощували на середовищі СМ ІМВ-72 протягом 72 годин при 33оС [48]. Клітини збирали центрифугуванням при 10000g протягом 20 хв.
2.2. Виділення глікокаліксу
Біомасу всіх досліджених мікроорганізмів збирали в фазі експоненційного росту. Виділення глікокаліксу проводили за наступною схемою [45]. Нарощену біомасу бацил та молочнокислих бактерій центрифугували 10 хв при 6000 об/хв, а молікутів 20 хв при 10000 об/хв; осад відмивали двічі ?-буфером (NaCl 0.156 M; Tris 0.05 M; 2-меркаптоетанол 0.01 М; дистильована вода; pH 7.4) [131]. До осаду додавали ??буфер в співвідношенні клітини : буфер - 1 : 5 і трипсин з розрахунку 0.1 мг/г осаду, контролюючи рН середовища, яке повинно бути 8,0, і ставили на 2 год при 37 0С на качалки (160 об/хв ). Потім центрифугували при відповідному режимі для певних видів мікроорганізмів, що досліджували, як описано вище. Осад знову промивали двічі ?-буфером, безклітинні рідини об`єднували і ліофільно висушували.
2.3. Візуалізація приклітинних вуглеводів за допомогою лектинів рослин мічених колоїдним золотом
На основі методик Horisberger з співавт. [102] і Хомутовського з співавт. [66] у відділі мікоплазмології ІМВ НАНУ було розроблено метод візуалізації приклітинних вуглеводів молікутів за допомогою мічених колоїдним золотом лектинів рослин [52]. З метою очищення клітин від речовин вуглеводної природи, присутніх в середовищі культивування, одержану біомасу клітин мікроорганізмів тричі відмивали буферним розчином А: 0,05 M Трис - HCl pH 7,0; 0,001 M MgCl2; 0,001 M MnCl2; 0,001 M CaCl2; 0,56 M NaCl. Після чого клітини осаджували центрифугуванням при 10000 об/хв протягом 15хв. Клітини ресуспендували у суспензії відповідного лектину, міченого колоїдним золотом, в співвідношенні об`ємів осад клітин : золь лектинів - 1 : 2. Суспензію клітин молікутів і золю лектинів залишали на 2,5 години при кімнатній температурі на качалці для зв`язування. Після цього проводили центрифугування і осад клітин тричі відмивали від незв`язаних лектинів тим же буфером, але вміст NaCl становив 0,28 М. Відмиті клітини наносили на сіточки, покриті формваровою плівкою, і аналізували за допомогою електронного мікроскопу (ЕМВ-100БР) при інструментальному збільшенні 30 тис. [138].
Інтенсивність взаємодії поверхневих моносахаридів у складі глікополімерів мікроорганізмів з відповідними лектинами оцінювали в умовних балах від 0 до 5 залежно від кількості часточок золота на поверхні клітин: 4-5, 5 - найвища ступінь взаємодії, 3-4, 4 - значна, 2-3, 3 - середня, 1-2, 2 - слабка, 0-1, 1 - майже відсутня, 0 - відсутня.
Лектини, мічені колоїдним золотом, були одержані з науково-виробничого кооперативу "Лектинотест" (м.Львів, Україна).
2.4. Газорідинна хроматографія моносахаридого складу глікокаліксу
Для ідентифікації нейтральних моносахаридів препарати гідролізували за допомогою 2N HCl протягом 5год при 1000С, а потім аналізували методом газорідинної хроматографії (ГРХ) у вигляді ацетатів поліолів [71] на приладі марки "Chrom-5" з полум'яно-іонізуючим детектором на колонці ( 3.0мм х 1.2м ) наповненій хромосорбом W ( 80-100меш ) за режимом хроматографії 1200С -170 0С, 30/хв.
2.5. Визначення амінокислотного складу глікокаліксу
До 3 мкг ліофільно висушеного глікокаліксу додавали 6N HCl, з розрахунку: на 1 мкг препарату - 0,2 мл кислоти. Розчин глікокаліксу в соляній кислоті запаювали в ампули і проводили гідроліз протягом 20 годин при 1000С, після чого промивали тричі дистильованою водою, додавали 1 мл цитратного буферу з рН 2,2 і визначали якісний та кількісний вміст амінокислот на аналізаторі амінокислот KLA-5 ("Hitachi", Японія) [89].
2.6. Серологічні методи досліджень
2.6.1. Зворотня реакція радіальної імунодифузії
2.6.1.1. Реагенти
В роботі використовували метод радіальної імунодифузії, який є напівкількісний й дозволяє визначати як антигени, так і антитіла в моносп