РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Об'єкт дослідження
В роботі було використано 14 видів дріжджів роду Candida 20 штамів: C. boidini T-2A, C. curvata, C. famata CBS 18, C. gropengiesseri ВКМ У-737, C. kefir штами: ВКМ У-209 і ВКМ У-701, C. lipolytica ВКМ У-917, C. macedoniensis штами: ВКМ У-832 і ВКМ У-1507, C. maltosa штами: ВКМ У-374 ВКМ У-516, C. guilliermondii штами: Microanthomyces alpinus і ВКМ У-10, С. pulcherrima ВКМ У-95, C. rhagii ВКМ У-1520, C. robusta ВКМ У-1093, C. sp. штами: УБФМ-454, УБФМ-457, УБФМ-555, C. tenuis ВКМ У-70, отриманих з колекції кафедри мікробіології ЛНУ ім. Івана Франка.
2.2. Середовища культивування та умови вирощування дріжджів
Середовища культивування та умови вирощування дріжджів, що використовувались в дослідах, відрізнялись в різних експериментах.
В дослідах, результати яких представлені в першому підрозділі 3.1 експериментальної частини дисертаційної роботи "Утилізація лактози дріжджами C. kefir ВКМ У-209. Утворення мікротілець і деякі інші регуляторні механізми їх гомеостазу під час утилізації етанолу і лактози", середовища культивування та умови вирощування дріжджів були наступними.
Дріжджі підрощували протягом доби при 30?С на чашках Петрі з твердим YPD такого складу (%): дріжджовий екстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, агар - 2. Добовий інокулят отримували в результаті культивування клітин в рідкому середовищі YPD при 30?С. Аерування культури проводили на круговій качалці (200 об./хв).
Клітини двічі стерильно відмивали дистильованою водою і переносили в модифіковане середовище Беркгольдера з лактозою чи етанолом. Час культивування 48 годин при 30?С. Модифіковане середовище Беркгольдера було такого складу (г/л ): КН2РО4 - 1; ( NH4)2SO4 - 3,5; MgSO4·7H2O - 0,5; CaCl2 - 0,1; сіль Мора - 0,0014. До середовища вносили мікроелементи з розрахунку 0,5 мл/л. Суміш мікроелементів містила (мкг/л): Н3ВО3 - 500; CuSO4·5Н2О - 40; КІ - 100; FeCl3·6H2O - 200; MnSO4·H2O - 400; ZnCl2 - 400; ( NH4)6Mo7O24· 4H2O - 200. До середовища додавали дріжджовий екстракт - 600 мг, лактозу - 20 г чи етанол - 10 мл.
Для створення аеробних умов культуру вирощували в 150 мл середовища в колбах Ерленмеєра об'ємом 500 мл і аерували на качалці (200 об./хв) при 30?С. Для досягнення слабкої аерації клітини вирощували в 130 мл середовища в колбах об'ємом 150 мл при ідентичній температурі і не аерували (стаціонарні умови).
Для визначення проценту виживання клітини відбирали через певні проміжки часу і висівали з розрахунку 100 колоній на чашку на середовище з лактозою.
В дослідах, результати яких представлені в другому підрозділі 3.2 експериментальної частини дисертаційної роботи "Утилізація етиламіну і олеату дріжджами C. kefir ВКМ У-209. Утворення мікротілець під час засвоєння етиламіну і олеату", середовища культивування та умови вирощування дріжджів були наступними.
Для дослідження утилізації олеату клітини вирощували при 30?С на круговій качалці (200 об./хв) у середовищі Беркгольдера, яке описане вище. До середовища додавали з розрахунку на л: дріжджовий екстракт - 600 мг; глюкозу - 1 г або не вносили зовсім. Після автоклавування до середовища додавали стерильний олеат в діапазоні концентрацій від 0 до 3%. Стерилізація олеату здійснювалась через бактеріальний фільтр. Для якісної оцінки росту клітини вирощували на агаризованому середовищі.
При вирощуванні клітин на етиламіні (30?С; 200 об./хв) середовище Беркгольдера не містило джерел азоту (сульфату амонію, дріжджового екстракту). До середовища додавали з розрахунку на л: тіамін - 400 мкг, біотин - 5 мкг; глюкозу - 10 г або не вносили зовсім. Стерильний етиламін вносили після автоклавування середовища в діапазоні концентрацій від 0 до 3%.
Для визначення активності амінооксидази інкубованих клітин з етиламіном, отримували добовий інокулят після культивування клітин в рідкому середовищі YЕPD при 30?С на круговій качалці. Клітини двічі стерильно відмивали дистильованою водою, осаджували центрифугуванням при 3000 об./хв протягом 10 хв, переносили в середовище Беркгольдера з етиламіном із глюкозою чи без глюкози та інкубували протягом 18 год. при 30?С на круговій качалці.
В дослідах, результати яких представлені в третьому підрозділі 3.2 експериментальної частини дисертаційної роботи "Біодеструкція вуглеводнів нафти дріжджами роду Candida. Участь пероксисом в цьому процесі", середовища культивування та умови вирощування дріжджів були наступними.
Інокулят отримували в результаті культивування клітин в середовищі Беркгольдера з глюкозою (2%) протягом доби при 30?С. Аерування культури проводили на круговій качалці (200 об./хв). Клітини вирощували у середовищі Беркгольдера, після стерилізації якого додавали неочищену нафту (в діапазоні концентрацій від 0 до 20%) із Старосамбірської свердловини № 8 Страшевицького родовища . В якості емульгатора використовували Твін 80 у співвідношенні до нафти 1:12. Клітини культивували у колбах Ерленмеєра об'ємом 50 мл в 10 мл середовища в умовах аерації на круговій качалці (200 об./хв) при 30?С протягом 3 і 4 діб.
2.3. Визначення біомаси
Біомасу інокуляту, а також клітин, вирощених у середовищі з лактозою і етиламіном, визначали фотоелектроколориметрично за мутністю розведеної суспензії клітин (?=540 нм, довжина оптичного шляху 3 мм). Біомасу клітин обчислювали за формулою
С(г/л) = E*n/k , (2.1)
де E - оптична густина суспензії клітин;
n - розведення суспензії клітин;
k - коефіціент перерахунку, отриманий ваговим методом;
Біомасу клітин, вирощених у середовищі з нафтою, визначали ваговим методом. Для цього клітини двічі відмивали дистильованою водою, осаджували центрифугуванням при 1000 об./хв протягом 15 хв, переносили в бюкси, які висушували при 105?С до