РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти досліджень
В роботі використовували аксенічну культуру ціанобактерії Plectonema boryanum Gom, штам CALU 465, яка отримана з колекції Біологічного Інституту Санкт-Петербурзького університету [99].
Ціанобактерію P.boryanum вирощували на середовищі Фітцджеральда та BG-11 [139] в 3 л колбах Ерленмейєра при t = 26 -28 0C, освітленні 1200 - 1800 лк та безперервній аерації повітрям з 5% CO2.
Початкова оптична густина інокуляту ціанобактерії в рідкому середовищі при вимірюванні на фотоелектроколориметрі ФЕК-56М (фільтр № 5, 600 нм) складала 0,25 одиниць оптичної густини (ОГ) в кюветі з довжиною оптичного шляху 1см. В експериментах використовували культуру ціанобактерії в логарифмічній стадії росту (6 - 8 доба вирощування). Концентрація клітин на цій стадії складала 3,5 -4?108 клітин в мл або біля 3-х одиниць ОГ [15].
В роботі використовувались клітини штамів E.coli XL1-Blue (F' proAB laclq?(lacZ)M15 / recA1 endA1 gyrA96(Nalr) thi1 hsdR17(rk-mk+) supE44 relA1 lac), DH1 (F? recA1 endA1 gyrA96 thi1 hsdR17 (rk-mk+) supE44 relA1) і J-53, які вирощувались в стандартних умовах на агаризованому чи в рідкому середовищі LB [7, 8].
2.2. Реактиви і препарати
В роботі були використані наступні реактиви і препарати: агароза марок: LGT -"Bio-Rad" (США), DNA - "Serva" (Німеччина) та "Pharmacia" (Швеція), SeaPlaque LG/MT "FMC Marine Golloids" (США); акриламід, бісакриламід, бромистий етидій, бромфеноловий синій, дітіотреітол, додецилсульфат натрію (SDS), натрієва сіль етилендіамінтетраоцтової кислоти (Na-ЕДТА), ПЕГ-6000, тріс - гідроксіметиламінометан, 2-меркаптоетанол - "Serva", нітроцелюлозні фільтри GF/C та ДЕАЕ-целюлозні DE81 "Whatman" (Англія), нітроцелюлозні мембранні фільтри #BA85 фірми "Schleicher & Schuell" (Німеччина), фільтрувальний папір Whatman 3MM, тритон Х-100 "Marck" (Німеччина).
Ферменти: лізоцим, панкреатична ДНК-аза, РНК-аза, вільна від ДНК-аз, полінуклеотидкіназа Т4 фірми "Serva". Ендонуклеази рестрикції фірм: "New Englend Biolabs" і "Sigma" (США), "Farmacia" (Швеція), "Serva" (Німеччина), НПО "Биотех" і "СибЭнзим" (Росія), "Fermentas" (Литва). Також були використані ДНК-аза I фірми "Worthington" (Англія), ДНК-лігаза Т4, нуклеаза S1 фірми "Биотех" (Росія), нуклеїнові кислоти: ДНК тимуса теляти, ДНК фага ? с1857, плазміди pUC19, pBluescript II SK+, pBR322, pGJ28, RP4 (НПО "Биотех", Росія).
Інші реактиви, що були використані в роботі, були вітчизняного виробництва кваліфікації "осч" і "хч".
В роботі були використані наступні буфери:
- буфер для зберігання ДНК
-ТЕ: 10 мМ трис-HCl; pH 8,0; 1 мМ ЕДТА;
- буфери для електрофорезу:
-ТБЕ: 89 мМ трис-борат, рН 8,0 2; мМ ЕДТА;
-ТАЕ: 40 мМ трис-ацетат, рН 8,0; 1 мМ ЕДТА;
- буфери для виділення плазмід із P.boryanum:
-SE: 0,12М NaCl; 0,05M ЕДТА; pH 8,0;
літичний буфер: 50 мМ глюкози, 25 мМ Tris-HCl, 10 мМ ЕДТА, рН 8,0;
- буфери для виявлення нуклеазної активності P.boryanum:
для елюції нуклеази з поверхні клітин:20 мМ трис-НCl pH 7,5 1 мМ -ЕДТА, 0,1% Тритон Х-100 [98];
для гідролізу ДНК: 20 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 10 мМ NaCl, 20 мМ однієї з солей: MgCl2, CaCl2, MnCl2 або ZnCl2;
- буфер для трансформації P.boryanum:
-10 мМ TrisHCl і 150 мМ CaCl2.
2.3. Виділення ДНК
Плазмідну ДНК з клітин E.coli виділяли методом лужної екстракції [7].
Плазмідну ДНК з клітин P.boryanum виділяли за методом лужної та фенольної екстракції [53], а також висолюванням з допомогою 1М NaCl з безклітинних препаратів [24, 53, 58] з деякими модифікаціями [6]. Для цього ціанобактеріальну культуру вирощували в об'ємі 2 л до ОГ = 1.0, що відповідає 3Х108 кл/мл. Потім ціанобактеріальні клітини осаджували центрифугуванням при 6 тис. об/хв. при кімнатній температурі протягом 10 хв. або збирали на фільтри під від'ємним тиском за допомогою вакуумного насоса. Утворений осад промивали двічі буфером SE. Біомасу ресуспендували в 45 мл свіжо приготовленого літичного буфера, нагрітого до 370С. Безпосередньо перед використанням, в буфері розчиняли лізоцим до кінцевої концентрації 450 мкг/мл. Літичну суміш інкубували при 370С протягом 2 год., постійно помішуючи на шейкері. Потім до суміші додавали 9 мл 10%-ного розчину SDS, завчасно нагрітого до 370С і знову залишали на 1 год. при постійному перемішуванні. До отриманої суспензії лізованих клітин додавали 5М розчин NaCl до кінцевої його концентрації 1М і ретельно перемішавши, залишали на ніч при 40С. Отриману драглисту суміш центрифугували при 12 тис. об/хв. протягом 30 хв. при 40С, відбирали надосад, в якому розчиняли 7,8 г ПЕГ600. Розчин витримували при температурі 40С щонайменше протягом 4 год. або залишали його на ніч, після чого утворювався драглистий осад. Після центрифугування при 8 тис. об/хв. протягом 0,5 год. на холоді ДНК з домішками у вигляді щільного, темного кольору осаду розчиняли в 20 мл буфера ТЕ. Розчин двічі екстрагували фенолом, насиченим буфером (рН 8,0) та один раз сумішшю насиченого фенолу та хлороформу в співвідношенні 1:1. Після обробки водної фази РНК-азою додавали два об'єму етанолу і залишали на 1 год. при -200С. Осад ДНК, після центрифугування двічі промивали 70%-ним етанолом, підсушували і розчиняли в 1 мл буфера ТЕ (рН 8,0).
При необхідності виділення плазмідної ДНК з ціанобактеріальних транскон'югантів, їх попередньо перевіряли на контамінацію донорними клітинами E.coli. Їх кількість не повинна перевищувати 10х101 клітин/мл. Для цього висівали аліквоту культуральної суміші з транскон'югантами на агаризоване середовище LB в чашках Петрі і інкубували при температурі 37 0С протягом 12 - 18 годин. Після того як утворювались колонії E.coli, підраховували титр їх клітин. Препарати ДНК зберігали при -200С.
Виділення і очистку фрагментів ДНК з агарозного гелю здійснювали за методом [127]. При необхідності додаткову очистку препаратів ДНК проводили