РОЗДІЛ 2
Матеріали і методи досліджень
2.1. Об'єкти дослідження
Об'ектом досл(дження було 11890 штамів M. tuberculosis, які виділяли з зразків клінічного матеріалу хворих на туберкульоз легень, які знаходилися на стаціонарному лікуванні в ІФП з 1990 по 2005 роки.
На L-форми МБТ було зд(йснено 1041 пос(в мокротиння від хворих на туберкульоз легень. Отримано і досліджено 129 культур L-трансформованих форм збудника туберкульозу, із них 92 культури реверсували в бактеріальну форму МБТ і були віднесені до нестабільних L-форм, а 37 культур реверсії не дали після 3-х пасажів in vitro і були віднесені до умовно-стабільних L-форм МБТ.
Вивчено біологічні властивості (морфологічні, культуральні, тинкторіальні, ферментативні, чутливість до АМБП) у 87 штам(в МБТ, отриманих після реверсії нестабільних L-форм. Досл(джено в(рулентн(сть для морських свинок у 12 ревертантних культур МБТ, отриманих із нестаб(льних L-форм збудника туберкульозу.
2.2. Методи та реактиви, використані у дослідженні
В роботі для посіву були використані щільні поживні середовища: яєчні Левенштейна-Єнсена (з окремих реагентів та комерційної сольової основи фірми HiMedia (Індія) і Фіна ІІ, комплекс нового поживного середовища зі стимулятором росту; рідкі - бульйон Міддлбрукка, Проскауера-Бека, Школьнікової; напіврідке середовище Дорожкової [66].
Передпосівну обробку клінічного матеріалу здійснювали за допомогою таких реактивів: 12,0 % Na3PO4, NALC-OH (N-ацетил-L-цисте(н з 1,0 % г(дроксидом натр(ю), 3,0 % розчин сірчаної кислоти [20].
Для збагачення бульйону Міддлбрукка використовували такі реактиви: ліофілізовану суміш антибіотиків для пригнічення супутньої мікрофлори BBL MGIT PANTA, яка складається з поліміксину В, амфотеріцину В, налідіксової кислоти, триметоприму, азлоциліну; суміш BBL MGIT OADC, яка складається з олеїнової кислоти, альбуміну бичачого, D-декстрози, С-каталази [20].
Для контроля придатност( щ(льного я(чного середовища користувалися лабораторним штамом Н37Rv. Паспорт штаму: штам M. tuberculosis особлива назва штаму Н37Rv 1/47, отриманий з (нституту г(г((ни м. Прага, дата отримання 1976 р.
При приготуванн( живильних середовищ та реактив(в готували наважки речовин 0,01 г ( вище, для чого використувалися торс(йні ваги, як( дозволяли визначати масу речовин з похибкою 0,0001 г.
Перев(рка вим(рювальних прилад(в проводилася сво(часно, що вказано в перев(рочних сертиф(катах метролог(чного контролю.
Для ідентифікації виділених штамів проводили наступні культурально-біохімічні тести: н(ациновий тест (наявність здатності продукувати нікотинову кислоту), нітратредуктазний тест, визначення окисно-відновних ферментів, визначення термостаб(льност( каталази, реакція гідролізу твіну-80 за допомогою тест-наборів фірми "TULIP" (Індія), визначення спроможност( росту кл(н(чних ізолятів м(кобактер(й на середовищ( з сал(циловокислим натр(єм та паранітробензойною кислотою [20, 133].
Для ПЛР-д(агностики в роботі було використано тест-набір MS-СКРИН для (ндикац(( комплексу M. tuberculosis/bovis з клінічного матеріалу [20, 134].
2.3. Експериментальні дослідження
Для відтворення специфічного патологічного процесу туберкульозної інфекції і отримання із тварин класичних, не змінених морфологічно штамів M. tuberculosis використовували найчутливіших до туберкульозної інфекції морських свинок.
В роботі було використано 37 морських свинок.
13 свинок вагою 250 - 300 г заражали підшкірно в праве заднє стегно по 0,1 мг вологої маси культури M. tuberculosis в об'ємі 0,5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію (для визначення вірулентності ревертантних штамів МБТ). Спостереження за тваринами проводили протягом 3-х місяців. Загиблим протягом цього терміну свинкам робили розтин та оцінювали індекс туберкульозних уражень лімфовузлів та внутрішніх органів. Якщо свинки не гинули протягом цього терміну, їх забивали за допомогою ефіру і робили розтин. Туберкульозні ураження оцінювали за методикою Р.Й. Драбкіної за якою максимальні ураження приймаються за 100 умовних одиниць [138].
Контролем була вірулентність лабораторного тест ? штаму МБТ Н37Rv, яким інфікували свинок в тій же дозі.
З метою відтворення експериментального туберкульозу морських свинок 8 тварин вагою 250 - 300 г заражали підшкірно шляхом введення лабораторного штаму M. tuberculosis Н37Rv в праве заднє стегно по 0,1 мг вологої маси в об'ємі 0,5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію. З тією ж метою 16 тварин розділили на 2 групи: 1-а група інфікувалася культурами, отриманими з нового середовища зі стимулятором росту, 2-а група - культурами, отриманими з середовища Левенштейна-Єнсена без малахітового зеленого, які попередньо були вирощені на новому середовищі зі стимулятором росту. Термін спостереження до 3-х місяців.
Гістологічні препарати готували з різних ділянок уражених органів тварин (селезінка, нирка, печінка, легені). Для цього шматочки органів морських свинок фіксували у 10,0 % нейтральному формаліні, здійснювали парафінову проводку. Розміщені на препаратне скельце зрізи депарафінували, для чого їх занурювали в дві ємкості з толуолом по черзі, витримували 5 хв., промокали фільтром. Далі відбирали три скельця зі зрізами, видаляли залишки вологи навколо них, поміщали в горизонтальне положення і наливали барвник до повного покриття препарату. Через 2 хв. зливали барвник зі скельця і занурювали його в дистильовану воду. Два інших скла звільняли від гематоксиліну через 4 - 6 хв. відповідно. Після промивки забарвленого гематоксиліном препарату в дистильованій воді, його виймали, видаляли залишки вологи і наносили розчин еозину на 4 - 5 хв. Після цього барвник зливали, препарат промивали дистильованою водою та проводили через спирти висхідної міцності, карбол-ксилол, ксилол, покривали бальзамом і накривали покривним скельцем [135].
Усього приготовлено, переглянуто та задокументовано в оптичному світловому мікроскопі Olympus BX 51з