РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкти дослідження
Робота проводилася з основним об'єктом досліджень - штамом-продуцентом батуміну "Pseudomonas batumici", а також з рядом тест-мікроорганізмів для визначення антибіотичної дії даного антибіотика.
2.1.1. Штам-продуцент батуміну "Pseudomonas batumici " 17
Об'єктом дослідження був штам "P.batumici" 17, одержаний шляхом мутагенезу, захищений патентом України ?121? і підтримуваний у відділі антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології НАН України. Штам зберігали у ліофілізованому стані при t= +5-10?С, а також на 0,5 % м'ясо-пептонному агарі (склад г/л: пептон - 10, NaCl - 5, м'ясний відвар - 100, агар - 5, pH 8,2 - 8,4 ) під шаром вазелинової олії при кімнатній температурі. Більш детально опис штаму та умов його зберігання будуть наведені у відповідному розділі результатів досліджень.
2.1.2. Штами тест-мікроорганізмів
Для дослідження спектру дії і активності антибіотика батуміну використовували міжнародні референс-штами тест-мікроорганізмів з Української колекції мікроорганізмів (УКМ), перелік яких наведено у табл. 2.1. Ці штами є загально прийнятими у світовій практиці для оцінки антимікробної дії певних антибіотиків і дезінфектантів, і включені в Фармакопеї всіх розвинених країн світу. Як тест-мікроорганізми використовувались також типові штами деяких видів мікроорганізмів, зокрема стафілококів.
Референс-штами зберігали при +5?С в ліофілізованому стані; типові штами - на оптимальних для них середовищах під шаром вазелинової олії при кімнатній температурі.
Таблиця 2.1
Референтні штами тест-мікроорганізмів
п/пНазва штаму, номер в УКМНомер в іншій колекції1231Arthrobacter globiformis Ac-661тATCC1 80102Aspergillus niger F-16693ATCC 164043Bacillus cereus B-908ATCC 117784Bacillus mycoides B-903 ГИСК2 0100235Bacillus pumilus B-912ATCC 271426Bacillus pumilus B-913NCTC3 82417Bacillus subtilis B-901ATCC66338Bordetella bronchiseptica B-922 ATCC 46179Candida albicans Y-2681ATCC 1023110Candida tropicalis Y-2473 ССM4 822311Candida utilis Y-984 LIA5 0112Clavibacter michiganensis Ac-629т ICMP6 255013Clostridium sporogenes B-924ATCC 1940414Escherichia coli B-916 ATCC 1053615Escherichia coli B-906 ATCC 2592216Escherichia coli B-926ATCC873917Klebsiella pneumoniae B-920 ATCC 1003118Micrococcus flavus Ac-634 ATCC 1024019Micrococcus luteus Ac-632 ATCC 10240а20Micrococcus varians Ac-613 ATCC 934121Mycobacterium phlei Ac-402тATCC 1175822Mycobacterium smegmatis B-917 ATCC 60723Proteus vulgaris B-905 ATCC 689624Pseudomonas aeruginosa B-900 ATCC 902712325Pseudomonas (Brevundimonas7) diminuta B-914 ATCC 1914626Saccharomyces cerevisiae Y-2474 ATCC 976327Salmonella Abony B-921 NCTC 601728Staphylococcus aureus B-904 ATCC 2592329Staphylococcus aureus B-4001 ATCC 6538 Р30Staphylococcus aureus B-918 ATCC 653831Staphylococcus aureus B-909 ГИСК 90632Staphylococcus capitis B-4002т ATCC 2784033Staphylococcus chromogenes B-4003т CCM 338734Staphylococcus cohnii B-4004т ATCC 2997435Staphylococcus epidermidis B-919т ATCC 1222836Staphylococcus intermedius B-4009т ATCC 2666337Staphylococcus lentus B-4010тATCC 2907038Staphylococcus saprophyticus B-4011т ATCC 15305 39Staphylococcus sciuri B-4012т ATCC 29076240Staphylococcus xylosus B-4014т ATCC 2997141Streptococcus feacalis B-915т ATCC 1054142Zygosaccharomyces rouxii Y-2475т CCM 8224 Примітки:
1 - АТСС: American Type Culture Collection, США;
2 - ГИСК: Государственный Научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича, Росія;
3 - NCTC: National Collection of Type Cultures, Велика Британія;
4 - ССМ: Czech Collection of Microorganisms, Чехія;
5 - LIA: Ленинградский институт антибиотиков, Росія;
6 - ICMP: International Collection of Microorganisms from Plants, Нова Зеландія.
7 - сучасна назва роду після таксономічної ревізії.
2.2. Фено- і генотипові дослідження
Для уточнення таксономічного статусу штаму "P.batumici" і його порівняння з іншими представниками роду Pseudomonas нами були проведені його фенотипові дослідження за основними характеристиками, що використовуються при ідентифікації псевдомонад, а також сіквенс гену 16S рРНК, тобто був використаний метод поліфазного таксономічного аналізу.
2.2.1. Фенотипові дослідження
Досліджували здатність до окислення глюкози на середовищі Хью і Лівсона [122], до складу якого входить (у %): пептон - 0,2, NaCl - 0,5, K2HPO4 - 0,03, агар-агар - 0,3, бромтимолблау (водорозчинний) - 0,003, глюкоза - 1.
Здатність до синтезу флюоресціюючого пігменту вивчали на середовищі Кінг В [123] ( г/л): пептон - 20, гліцерин - 10, K2HPO4 - 1,5, MgSO4 - 1,5, агар-агар - 16.
Для вивчення оксидазної реакції [124] використовували 1% водний розчин солянокислого диметил-парафенілендіаміну. Біомасу добової культури наносили на змочений розчином фільтрувальний папір. При оксидазопозитивній реакції відбувалось окислення диметилпарафенілендіаміну, при цьому колір змінювався з безбарвного на червоний.
Для вивчення здатності бактерій до анаеробного розщеплення аргініну за допомогою аргініндегідролази використовували метод Меллера [125]. Також досліджували здатність культури до утворення левану з сахарози [126] та денітрифікації [127].
Спектри вуглецевого живлення бактерій досліджували на синтетичному середовищі Козера (в г/л): агар-агар - 15, NaCl - 5, MgSO4 - 0,2, NH4H2PO4 - 1, K2HPO4 - 1, з додаванням 0,1% відповідного джерела вуглецю.
2.2.2. Генотипові дослідження. Сіквенс гену 16 S рРНК
Сіквенс гену 16 S рРНК проводили згідно методики Beek [128].
Добову культуру ""P.batumici"" вирощували на МПА, змивали фізіологічним розчином і центрифугували (5000 об/хв., протягом 5 хв.); осад клітин відмивали дистильованою водою і ре