Підвищення життєздатності кріоконсервованих статевих клітин півнів.

РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования выполнены в лаборатории репродукции птиц Института птицеводства
Украинской академии аграрных наук. Исследования проведены на сперме петухов
пород: род-ай­ланд, юрловские голосистые, белый леггорн. Применялось клеточное
содержание птицы в помещениях с регулируемым микроклиматом. Петухов содержали в
индивидуальных клетках, а кур – в групповых, по 4 головы в каждой. Группы кур и
петухов подбирались по принципу аналогов. В исследованиях использовалась только
взрослая, клинически здоровая птица. Кормление кур и петухов проводили по
рационам, разработанным отделом физиологии и питания птиц Института
птицеводства УААН в соответствии с общепринятыми нормами.
. Оценка качества спермы петухов до и после её замораживания
Сперму у петухов получали общепринятым методом массажа [131,132] абдоминальной
области, для исследований использовали разделённые смеси эякулятов нескольких
петухов. Для этого вынимали из клетки петуха и фиксировали его ноги коленями.
Затем поглаживали мягкую часть живота петуха, между килем и каудальной частью
лонных костей, а также спину у основания хвоста. Проявление рефлекса эрекции
было заметно по приподниманию хвоста и выпячиванию копуляторного органа. В этот
момент, захватывая копуляторный орган большим и указательным пальцами правой
руки, выдавливали сперму в подставленный стеклянный спермоприёмник. Полученную
сперму исследовали по объёму эякулята, концентрации спермиев, подвижности и
выживаемости, количеству целых и повреждённых спермиев.
Для определения объёма эякулята (мл) использовали мерный спермоприёмник.
Концентрацию спермиев (млрд/мл) определяли в камере Горяева [13] или же
использовали флуоресцентный метод с применением этидиум бромида
(2,7-диамино-10-этил-9-фенилфенантридиум бромид) согласно известного метода
[83].
Подвижность спермиев оценивали общепринятым методом [13] под микроскопом (ґ450)
в висячей капле на термостолике при температуре 37°C. Выживаемость спермиев
(условные единицы) изучали по общепринятой методике [47], используя для
определения показателя известную формулу:
где - подвижность спермиев через определённый промежуток времени, - время между
измерениями подвижности.
Определение количества спермиев с целыми и повреждёнными мембранами головок
проводили по известному методу [89,156] с использованием флуориметра. При этом
измеряли люминесценцию образцов в области 380-900 нм. В приборе использовали
кварцевую кювету объёмом 5 мл, минимальный рабочий объём составлял 2 мл. В
качестве флуорохрома использовали этидиум бромид, который очень слабо
люминесцирует в растворе, но при попадании в клетку и связывании с молекулами
ДНК резко увеличивает интенсивность люминесценции [130,188,189,191]. Как
известно, этидиум бромид медленно диффундирует через нативные мембраны клеток и
легко проникает в повреждённые спермии [37,58,156]. Так, интенсивность
люминесценции спермиев петуха в присутствии этого красителя достигает 50% через
40-50 мин, и только через 1,5 часа он проникает во все клетки. Концентрация
спермиев пету­хов в кювете составляла 15-30х10-4 клеток/мл, что соответствовало
оптимальному количеству согласно известному методу.
Для повреждения мембран спермиев был применён дигитонин в концентрации 10-4М.
Измерения были проведены в среде, содер­жащей 120 мМоль NaCl, 50 мМоль
трис-HCl, рН 7,0, 3х10-2 мМоль этидиум броми­да, при возбуждающем свете 365 нм
и регистрации в люминесценции в области 610 нм. По отношению уровней
люминесценции до и после введения дигитонина определяли количество спермиев, не
имеющих повреждения мембран головок [89].
Для определения спермиев с повреждёнными и нативными акросомами было применено
прижизненное окрашивание флуоресцентными красителями по известному методу [83].
Применение смеси красителей этидиум бромида и тиазинового красного в этом
методе даёт возможность подробно идентифицировать характер повреждения спермиев
(нормальная головка - повреждённая акросома, повреждённая головка -
повреждённая акросома и т.д.). Для осуществления метода использовали среды,
применяемые при разбавлении спермы, в которые вводили этидиум бро­мид и
тиазиновый красный в количестве 0,001 и 0,006 мас.%, соответственно. Затем
смешивали в соотношении 1:10 сперму и питательную среду, содержащую флуорохром,
наносили на предметное стекло каплю смеси и плотно накрывали покровным стеклом
так, чтобы движение спермиев было ограничено. После этого препарат помещали под
люминесцентный микроскоп (МЛ-2). При этом использовали возбуждающий свет с
длиной волны 365 нм, а флуоресценцию наблюдали в области 500-700 нм. Препарат
рассматривали под иммерсией при увеличении не менее 90Ч15 в отражённом свете. В
поле зрения учитывали число повреждённых и нормальных спермиев. При этом на
тёмно-синем фоне четко просматривались более светлые спермии, которые относили
к нормальным. При повреждении акросомы, когда нарушалась проницаемость её
мембраны, тиазиновый красный, проникая внутрь акросомы, вызывал её
светло-салатное свечение. При более глубоком повреждении акросомы чаще всего
приобретали шаровидные формы, а тиазиновый красный вызывал её интенсивное
ярко-малиновое свечение. При повреждении цитоплазматической мембраны спермиев
этидиум бромид проникал в клетку и, связываясь с ДНК, вызывал ярко-малиновое
свечение головки спермия [83].
Данный экспресс-метод оценки качества спермы петухов позволяет объективно
устанавливать повреждения головок и акросом спермиев, и достаточно точен.
Однако в процессе работы мы столкнулись с такими его недостатками: для его
осуществления требуется стационарное оборудование, его невозможно использовать
в