РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2. 1. Штами бактерій і плазміди.
Штами бактерій, які використані у роботі, представлено у табл. 2. 1. Штами
Agrobacterium tumefaciens NTL4, A. tumefaciens NT1 (pTIC58ДaccR) та A.
tumefaciens NT1 (NTL4) були люб’язно надані д-ром Л. Халда-Алія (У-т Міссісіпі,
США). Штам P. aureofaciens H16 люб’язно наданий д-ром К. М. Злотніковим (РФ).
Плазміди: pSup2021Lux (ApR, KmR) - з колекції лабораторії, pCAM120 (ApR, KmR)
отримано від К. Вільсон (США).
Ендонуклеази рестрикції, Taq ДНК-полімераза та інші реактиви для ПЛР –
комерційні препарати фірми “MBI Fermentas” (Литва). Ферменти зберігали при –20
єС.
Хімічні реактиви. Для буферів та середовищ використано солі виробництва фірми
“Merck” (ФРН) кваліфікації “pro analysi”, для „молекулярно-біологічних
досліджень” придбані у фірмах “Merck” (ФРН), “SIGMA” (США). Решта реактивів
були вітчизняного виробництва і мали кваліфікацію “осч“ та “хч“.
Праймери для детекції псевдомонадних бактерій та для виявлення інтегронів у
бактеріальних ДНК синтезовано фірмою „Синтол” (Росія) і представлено у табл. 2.
2.
Антибіотики канаміцин, ампіцилін, ріфампіцин використовували в концентрації
100, хлорамфенікол – 30, тетрациклін та гентаміцин – 30 мкг/мл. X-Gal
(5-бромо-4-хлоро-3-індоліл-в-піранозид) використовували в концентрації 40
мкг/мл, X-GlcA (5-бромо-4-хлоро-3-індоліл-в-D-глюкуронід) – 50 та 100 мкг/мл
(обидва реагенти виробництва фірми “Sigma - Aldrich Chemie GmbH” (ФРН).
Таблиця 2. 1
Список штамів бактерій, використаних у роботі
Штам
Походження
Pseudomonas sp. ІМБГ 163
Ін-т молекулярної
біології та генетики
НАН України
Pseudomonas sp. ІМБГ 168
Те саме
Pseudomonas sp. IMБГ 287
-“-
Pseudomonas sp. IMБГ 288
-“-
Pseudomonas sp. IMБГ 294
-“-
Pseudomonas syringae subsp. atrofaciens 297
-“-
Xanthomonas axonopodis subsp. phaseoli 296
-“-
Escherichia coli S17-1 lpir
-“-
Paenibacillus sp. ІМБГ 156
-“-
Klebsiella oxytoca ІМБГ 26
-“-
Pseudomonas aureofaciens H16
Ін-т біохімії і фізіології мікроорганізмів, Пущіно, Росія
Pseudomonas syringae subsp. syringae 295
Ін-т мікробіології та вірусології імені Д. К. За-болотного НАН України
Erwinia carotovora subsp. atroceptica 9027
Те саме
Pseudomonas fluorescens ІМВ 17
-“-
Pseudomonas putida ІМВ 1934
-“-
Pantoea agglomerans 1а
-“-
Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pLR4)
У-т Міссісіпі, США
Agrobacterium tumefaciens NT1 (pTIC58ДaccR)
-“-
Agrobacterium tumefaciens NT1 (NTL4)
-“-
2. Середовища
Для вирощування бактерій використовували середовища LB, M9 [Міллер, 1976],
Kінга Б [King et al., 1954], середовища на основі фосфатного буфера з
додаванням джерел вуглецю та азоту.
Середовище Kiнга Б: пептон – 20 г, гліцерин – 10 г, K2HPO4 – 1,5 г, MgSO4? 7H2O
– 1,5 г, вода дистильована – до 1 л, pH до стерилізації – 7,2. Середовище
використовувалося для виявлення флуоресцентних пігментів піовердинів у
природних бактеріальних ізолятів, вивчення антимікробної активності, відборі
мутантів за синтезом сидерофорів [King et al., 1954].
Середовище Kiнга А: пептон – 20 г, гліцерин – 10 г, K2SO4 – 10 u, MnCl2 – 1,4
мкг, вода дистильована – до 1 л, pH до стерилізації – 7,2. Середовище
використовувалося для виявлення пігменту піоціаніну у природних бактеріальних
ізолятів [King et al., 1954].
Середовище Гісса: пептон – 10 г, NaCl – 5 г, 1 % досліджуваного вуглеводу,
дистильована вода – до 1 л, pH до стерилізації – 7. Як індикатор додавали 1,6 %
спиртовий розчин бромтимолблау у співвідношенні 1 мл на 1 л середовища.
Середовище використовували для визначення ферментації цукрів [Утевский, 1965].
Середовище MZ: KNO3 – 1,75 г, Na2HPO4 x 12H2O – 1,4 г, Na2SіO3 (або цеоліт) –
10 г, MgSO4 x 7H2O – 1,3, сахароза – 2,5 %, вода дистильована – до 1 л, pH до
стерилізації – 7,0. Середовище використовувалося для спільного культивування
бактерій.
Середовище Мурасіге-Скуга: NH4NO3 – 1,65 г, KNO3 – 1,9 г, CaCl2 х 2H2O – 0,44
г, MgSO4 х 7H2O – 0,37 г, KH2PO4 – 0,17 г, вода дистильована до – до 1 л.
Середовище використовувалося для спільного культивування бактерій.
Мікроелементи: Na2EDTA – 37,8 мг, FeSO4 х 7H2O – 27,8 мг, Na2MoO4 - 0,25 мг,
CuSO4 х 5H2O – 0,025 мг, CoCl2 х 6H2O – 0,025 мг, H2BO3 – 6,2 мг, MnSO4 х 4H2O
– 22,3 мг, ZnSO4 х 7H2O – 8,6 мг, KJ – 0,83 мг, вода дистильована до – до 1 л.
До макро- та мікроелементів додавали тіамін (2,0 мг/л), піридоксин гідрохлорид
(0,8 мг/л), сахарозу (20 г/л). Вміст агару у середовищі складав 0,8%.
Середовище використовувалося для клонального мікророзмноження картоплі
[Murachige, Scoog, 1962; Катаева, Бутенко, 1983].
Рослинний матеріал. У дослідженнях використано сорти картоплі селекції
Інституту картоплярства УААН та з колекції Інституту агроекології та
біотехнології УААН.
Таблиця 2. 2
Праймери, які використовували у дослідженні
Праймери
Послідовності
9 -27
5' GAG TTT GAT CCT GGC TCA G 3'
PCMG
5' CCT TCC TCC CAA CTT 3'
HS286
5' CVG ATT GTT MAG CRA GKT CGS CT 3'
HS287
5' GCS GCT KAN CTC VRR CGT TAG SC 3'
2. 3. Методи досліджень
Визначення антагоністичної активності у бактерій. Антагоністичну активність
бактеріальних штамів визначали in vitro в тестах на чашках Петрі з нанесенням
верхнього агару з індикаторною культурою. Досліджувані бактерії вирощувалися на
чашках з твердим середовищем КБ або LB протягом 1-2 діб. Верхній шар, що
включав культуру індикаторного штаму, суспендовану в охолодженому до 45 єС
розплавленому м’якому агарі (0,7 % агар у LB-середовищі) рівномірно
розподілявся на поверхні базового шару чашок, на якому росли бактерії.
Здатність до антагоністичної активності визначалася за наявністю зон
пригнічення росту індикаторної культури у верхньому шар
- Київ+380960830922