РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Матеріали
Для досліджень було використано такі реактиви:
* набір для колориметричного визначення активності холінестераз в сироватці
крові та плазмі крові (“Randox.U.A.”, United Kingdom);
* для визначення активності аспартат- та аланінамінотрансфераз в сироватці
крові використовували стандартні набори (Реагент, Дніпропетровськ);
* досліди на тимоцитах проводили в середовищі Хенкса („Sigma”, „Aldrich Chemie
GmbH” (Німеччина);
* субстрат для лактатдегідрогенази - лактат натрію („Sigma”, „Aldrich Chemie
GmbH” (Німеччина),.
* БуХЕ із сироватки крові коня (КФ 3.1.1.8), виробництва фірми “Sigma”-“Aldrich
Chemie GmbH” (Німеччина), з активністю 13 од. акт./мг препарату та БуХЕ з
сироватки крові людини (КФ 3.1.1.8) виробництва фірми “Sigma”-“Aldrich Chemie
GmbH” (Німеччина), з активністю 6,4 од. акт./мг препарату;
* субстрат БуХЕ - бутирилхолінхлорид (“Sigma”, “Aldrich Chemie GmbH”
(Німеччина));
* фосфотриестераза з Pseudomonas diminuta (КФ 3.1.8.1.) з активністю 2000 од.
акт./мл препарату була люб’язно надана для досліджень проф. Фраком Раушелом
(США);
* субстрат фосфотриестерази – параоксон метил (“Sigma”- “Aldrich Chemie GmbH”
(Німеччина));
* для іммобілізації ферментів застосовували: 25% водний розчин глутарового
альдегіду фірми “Serva” (Німеччина) та фотополімер полі(вініл)алкоголь із
вмістом стирилпіридину (PVA/SbQ) (SPP-H-13, Toyo Gosei Kogyo Co.Ltd, Японія);
* для стабілізації біоматриць в них додавали сироватковий альбумін бика (БСА)
фірми “Serva”;
* для інгібіторного аналізу використовували кристалічні a-соланін та a-чаконін
з пагонів Solanum tuberosum від “Sigma”-“Aldrich Chemie GmbH” (Німеччина).
* матеріали для тонкошарової хроматографії:
а) пластинки з силікагелем як сорбент марки Сорбфіл (Росія).
б) хлороформ, метанол, гідроксид амонію, 95% етанол та інші використані
реактиви мали кваліфікацію “осч” або “хч”
в) при проявленні хроматограм застосовували хлорид сурми (ІІІ) та дихлорметан
від Sigma.
* Картопля 14 сортів (ранні: (Повінь, Серпанок, Бородянська рожева),
середньоранні (Світанок київський, Водограй, Обрій, Купава, Забава),
середньостиглі ( Слов’янка, Явір, Луговська) та середньопізні (Ракурс, Зарево,
Промінь) врожаю 2003 року для дослідів на вміст алкалоїдів було отримано від
Інституту картоплярства УААН.
Реагенти для приготування буферних розчинів та середовищ інкубації мали
кваліфікацію „чда” та „хч”.
2.2. Приготування розчинів СГА
До 5 мг сухого чаконіну додавали 2 мл дистильованої води, після чого маленькими
порціями (приблизно по 50 мкл) додавали 100 мМ розчин оцтової кислоти до
зникнення помутніння розчину. Кінцева концентрація оцтової кислоти у вихідному
розчині не повинна перевищувати 5 мМ, щоб уникнути інгібування ферменту самою
оцтовою кислотою. Суміш доводили до об’єму 2,5 мл, тобто кінцева концентрація
інгібітора становила 2 мг/мл (2,3 мМ). З цього розчину готували 0,5 мл 1 мМ
розчину чаконіну. Таким же чином готували 1 мМ розчин соланіну.
2.3. Методика визначення СГА за допомогою тонкошарової хроматографії
Підготовка проб
З картопляних бульб зрізали шкірку (3-4 мм), подрібнювали та сушили при 35оС 2
доби. Кінцева вага зразків за рахунок втрати вологи складала в середньому 25%
від початкової. Потім зразки розтирали до порошкоподібного стану.
Екстракція СГА
2 г порошку поміщали в круглодонну колбу і заливали 15 мл суміші метанол -
оцтова кислота (95+5, v/v) (А) [Bodart et al., 2000]. Колбу під’єднували до
зворотнього холодильника і тримали на водяній бані, періодично струшуючи, при
температурі кипіння метанолу (700С). Надосадову рідину зливали в колбу, а до
осаду знову додавали 15 мл суміші (А). Загалом процедуру повторювали тричі.
Зібрану рідину фільтрували та випарювали на роторному випарювачі при 400С до
сухого залишку. Останній розчиняли в 1 мл суміші (Б) метанол-оцтова кислота
(99+1, v/v) [Bodart et al., 2000]. Отриманий екстракт використовували для
хроматографічного аналізу.
Розділення соланіну та чаконіну на пластинках Сорбфіл
1. Підготовка носіїв. Перед використанням пластинки Сорбфіл з дрібнозернистим
силікагелем активували, проганяючи по них метанол у хроматографічній камері.
Потім пластинки висушували на повітрі 15-20хв.
2. Приготування зразка. Вихідний розчин (стандарт) соланіну та чаконіну на
суміші (Б) мав концентрацію 0,4 мг/мл (у 5 мкл 2 мкг СГА).
3. Нанесення. Зразки для хроматографічного аналізу наносили за допомогою
самплерів на лінію старту. Плями з d = 3-4 мм були розташовувані на відстані
1,5-2 см одна від одної та 2,5 см від краю пластинки для того, щоб вони не
занурювались в розподіляючу суміш.
4. Розділення. Суміш хлороформ:метанол:2% водний розчин гідроксиду амонію у
співвідношенні 70:30:5 [Simonovska et al., 2000] вносили на дно
хроматографічної камери на висоту 1 см.
Для розподілу СГА використовували метод висхідної, одновимірної хроматографії;
розділяючий шлях 8,5 см. Оптимальне розділення соланіну та чаконіну мало місце
при 18?200С. Після завершення хроматографії пластинки висушували в
горизонтальному положенні до повного випаровування залишків розчинників.
5. Візуалізація аналітів. Для проявлення хроматографічних плям використовувався
хлорид сурми (ІІІ), як специфічний барвник на стероїдні глікозиди, внаслідок
взаємодії SbCl3 з подвійним зв’язком стероїду з’являється малинове забарвлення
[Шталь, 1965; Bodart, 2000]. Оскільки хлорид сурми є специфічним барвником на
стероїди, для визначення соланіну чи чаконіну можна використовувати одну й ту ж
калібрувальну криву.
Пластинки на кілька секунд занурювали в 2М розчин SbCl3 розчинений у суміші
оцтова кислота: дихлорметан (1+3, v/v) і підсушували на повітрі
- Київ+380960830922