РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Відбір матеріалу та підготування його для досліджень
Досліди проведені на самцях щурів лінії Вістар, які утримувались на
стандартному раціоні віварію. В процесі роботи використано 540 тварин. В
експерименті досліджували щурів трьох вікових груп: 3-місячного віку (період
статевого дозрівання; молоді), 6-місячного віку (період статевої зрілості;
дорослі) і 18-місячні (період старості; старі).
Кадмієвий токсикоз викликали шляхом щоденного внутрішньочеревного введення
кадмію сульфату в 0,9 % розчині натрій хлориду, з розрахунку 0,134 мг/100 г
ваги, що становить 1/50 LD50 [27, 129]. Натрію селеніт в 0,9% розчині натрій
хлориду вводили внутрішньочеревно в дозі 2 мг/кг ваги [117]. б-Токоферолу
ацетат вводили внутрішньом’язoво в дозі 10 мг/100 г ваги тіла у вигляді 10%
розчину в олії [118]. Інтактним тваринам внутрішньочеревно вводили відповідну
кількість 0,9% розчину натрій хлориду. Тварин декапітували під легким ефірним
наркозом на 14 добу від початку досліду.
Предметом дослідження були цільна кров, плазма крові, а також паренхіматозні
органи: печінка, нирки, селезінка, легені, серце.
Всі дослідні тварини були поділені на 6 груп: I- інтактні тварини; II –
тварини, отруєні кадмію сульфатом; III- тварини на протязі перших трьох діб
досліду отримували розчин кадмію сульфату, а починаючи з четвертої доби,
додатково, - натрію селеніт; IV- на протязі перших трьох діб проведення досліду
тварини даної групи отримували натрію селеніт, а починаючи з четвертої доби, -
додатково кадмію сульфат; V – тварини отруєні кадмію сульфатом, а починаючи з
четвертої доби, - додатково вводився б-токоферолу ацетат; VI – введення
тваринам б- токоферолу ацетату, а починаючи з четвертої доби, додатково –
кадмію сульфату. Проведено 3 серії дослідів на 540 тваринах. У першій серії
визначали інтенсивність кумуляції та розподілення кадмію в організмі інтактних
та щурів отруєних кадмію сульфатом, біохімічні показники та показники кислотно
– лужного стану крові 3-х місячних щурів, у другій - у 6–місячних і в третій –
у 18–місячних тварин.
Зразки печінки, нирок, селезінки, легенів та серця, відбирались згідно з
вимогами ГОСТ 26929-94 [30].
З відібраних зразків готували середні проби (обов’язково в паралелях) масою 40
г, поміщали в чисті фарфорові тиглі і висушували в сушильній шафі при t0 +
1050С до абсолютно сухого стану. Після цього, тиглі з пробами поміщали в
нагріту муфельну піч з (t0 + 2500С), температура в якій поступово піднімалась
на 500С через кожні 30-60 хв., доводячи таким чином температуру в муфельній
печі до + 4500С. За таких умов мінералізацію продовжували до набуття золою
сталого, специфічного для кожного органу, кольору без обвуглених чорних
частинок. Важкі метали екстрагували із золи шляхом розчинення останньої
концентрованою азотною кислотою. Для вимірювання вмісту токсичних металів на
атомно-абсорбційному спектрофотометрі AAS-30, готували розчини з певним
розведенням [31].
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Визначення вмісту кадмію у біологічних зразках
Вміст кадмію у печінці, нирках, селезінці, легенях та серці, визначали
спектрохімічним методом [138, 222], використовуючи режим абсорбції в
повітряно-ацетиленовому полум’ї на атомно-абсорбційному спектрофотометрі AAS-30
фірми Карл Цейс (Німеччина) [51,143]. В якості контрольних розчинів
використовували стандартні розчини кадмію.
2.2.2. Визначення показників кислотно-лужного стану крові щурів. У пробах крові
визначали показники кислотно-лужної рівноваги: (рН, рівень бікарбонатів,
величина буферних основ, насиченість СО2 та О2, сумарна кількість
вуглекислоти), на мікроаналізаторі газів крові “RODELKIS” (Угорщина) [2, 110].
Визначення біохімічних показників крові проводилось на біохімічному аналізаторі
Microlab–200, Нідерланди. Дослідження проводились згідно методикам, що
визначені інструкцією, з використанням стандартних наборів реагентів фірми
HUMAN UKRAINE (Україна).
2.2.3. Визначення активності аланінамінотрансферази у крові (АлАТ)
Матеріал для зразка: сироватка крові, плазма крові.
Принцип методу: Аланінамінотрансфераза каталізує перенесення аміногрупи від
аланіну на 2-оксаглутарат з утворенням глутамату та пірувату. Піруват, що
утворюється, у присутності лактатдегідрогенази, перетворюється в лактат, з
паралельним окисненням NADH.
б – оксаглутарат + L-аланін > L-глутамат + піруват
Піруват + NADH + H+ > лактат + NAD.
Швидкість зменшення абсорбції при 340 нм прямо пропорційна активності
аланінамінотрансферази.
Реагенти: реагент
L-аланін 400 ммоль/л;
LDH 2000 U/l;
NADH 0,25 ммоль/л;
б – оксаглутарат 12 ммоль/л
У пробірку вносили реагент у кількості 500 мкл і додавали 50 мкл проби. Проба
змішується з реагентом безпосередньо перед проведенням аналізу. Визначення
активності аланінамінотрансферази у зразку проводиться згідно інструкції, що
надається до приладу.
2.2.4. Визначення активності аспартатамінотрансферази (АсАТ)
Матеріал для зразка: сироватка крові, гепаринізована плазма.
Принцип методу. Кінетичний метод визначення активності АсАТ, що відповідає
рекомендаціям експертів Міжнародної спілки клінічної хімії (IFCC).
2-кетоглутарат + L-аспартат - L-глутамат +оксалоацетат
оксалоацетат +NADH + H+ - L-малат + NAD+
Реагенти: реагент 1 (фермент)
Трис-буфер (рН 7,5) 80 ммоль/л;
L-аспартат 240 ммоль/л;
Лактат-дегідрогеназа 600 Е/мл;
Малат-дегідрогеназа 600 Е/мл;
NADH 0,18 ммоль/л;
реагент 2 (субстрат)
2-кетоглутарат 12 ммоль/л;
В пробірку вносили 500 мкл реагенту 1 і 100 мкл реагенту 2. Додавали 50 мкл
сироватки крові. Проба змішується з реагентом безпосередньо
- Київ+380960830922