РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Отримання алкалоїдів і тритерпенів
Чистотіл збирали наприкінці травня під час найбільш рясного цвітіння [12, 20].
Свіжезібрану сировину сушили у термостаті при температурі 50-60°С з доброю
вентиляцією, розкладаючи рослини тонким шаром. Сировину вважали сухою, коли
стебла при згинанні набували ламкості [52].
Коріння чистотілу заготовляли на весні, коли починає відростати наземна частина
рослини, або восени (вересень – жовтень), після відмирання наземної частини
рослини. Сировину швидко сушили при кімнатній температурі у темноті [36].
Насіння чистотілу збирали у період дозрівання (серпень).
2.2. Тонкошарова хроматографія алкалоїдів і тритерпенів
Для ідентифікації та контролю розділення алкалоїдів та тритерпенів у рослинній
сировині використовували тонкошарову хроматографію (ТШХ). Хроматографію
здійснювали на пластинках “Silufol” (Чехія) із закріпленим шаром сорбенту.
Під час хроматографії на лінію старту, яка знаходилася 1,5-2 см від нижнього
краю пластинки, капіляром або спеціальною піпеткою наносили розчин
досліджуваних речовин. Для розділення речовин застосовували метод висхідної
хроматографії, під час якої край пластинки занурювали у суміш відповідних
розчинників, яку наливали у хроматографічну камеру за 15-20 хвилин до часу
проведення аналізу для насичення камери парами розчинника. Шар рідини у камері
становив не менше 5 мм. Як рухому фазу використовували три системи розчинників:
хлороформ – бензен – метиловий спирт – діетиламін (4,5:0,5:5:0,5) і хлороформ –
бензен – метиловий спирт – оцтова кислота (4,5:0,5:5:0,5) для алкалоїдів,
хлороформ – бензен – метиловий спирт (4,5:0,5:5) та хлороформ – метиловий спирт
(9:1) для тритерпенів. Після проходження розчинника на висоту 15 см пластинку
виймали з камери та підсушували. Алкалоїди чистотілу виявляли на хроматограмі
за флюоресценцією в УФ-світлі. Для виявлення речовин, які невидимі в УФ-світлі,
хроматограму проявляли парами кристалічного йоду. Для цього пластинку
витримують декілька хвилин у камері насиченій парами йоду [10, 27, ,53].
2.3. Дослідження цитотоксичності речовин
Клітини лінії L1210 висівали у 24-лункові пластикові планшети в середовищі RPMI
(“Sigma”, США) у присутності 10% сироватки крові ембріонів великої рогатої
худоби (“Sigma”, США). Через 24 годин додавали досліджувану речовину в різній
концентрації. Підрахунок кількості клітин здійснювали через певні проміжки часу
в гемоцитометричній камері. Концентрацію клітин у суспензії визначали за
формулою: с = 12500n, де с – кількість клітин в 1 мл суспензії, n – середня
кількість клітин в 5-ти великих квадратах камери. Відсоток мертвих клітин
визначали після їх фарбування 0,1 % (w/v) розчином трипанового синього та
підрахунку зафарбованих клітин у світловому мікроскопі (Біолам, “ЛОМО” МЛ 3)
живі клітини за цих умов не фарбуються.
Величина ІС50 дорівнює концентрації препарату, яка необхідна для зменшення
загальної кількості клітин на 50 % у порівнянні з контролем після інкубації
клітин протягом 48 годин.
2.4. Визначення фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів крові людини
Визначення кількісних показників фагоцитарної активності нейтрофільних
гранулоцитів здійснювали за допомогою модифікованого методу оцінки поглинальної
здатності фагоцитів [34].
Отримання лейкоцитарного концентрату здійснювали у пластиковому шприці з
мінімальною кількістю операцій для уникнення травмування лейкоцитів. Для
прискорення осідання еритроцитів та отримання лейкоцитів крові застосовували 5%
розчин декстрану Т-500 (Loba Feinchemie, Австрія), який готували на фізрозчині
(0,9 % NaCl), розливали в ампули і стерилізували автоклавуванням (120°С,
2 атм.). Аліквоту гепаринізованої крові (кінцеве розведення лікарського
препарату гепарину 1:100) змішували з 1/5 об’єму 5% розчину декстрану Т-500
(кінцева концентрація декстрану 1%) і залишали шприц під кутом 45° на 20-30
хвилин, періодично змінюючи положення шприца для кращого відділення
еритроцитів. Після цього верхній шар плазми із лейкоцитами витискували із
шприца у пластикову пробірку типу Еппендорф через пластиковий капіляр, яким
заміняли голку, і визначали кількість і співвідношення лейкоцитів у плазмі. Для
цього аліквоту 20 мкл плазми крові центрифугували при 1500 об/хв 1-2 хв,
надосадову плазму максимально видаляли, клітини суспендували у 37 мкл розчину
1% оцтової кислоти з 0,05% метилового зеленого (“Sigma”, США). Ядра
гранулоцитів і лімфоцитів рахували у гемоцитометричній камері (мікроскоп “ЛОМО”
МЛ 3, 40Ч10), у 25 великих квадратах камери. Із отриманих даних розраховували
кількість лейкоцитів у плазмі крові і співвідношення гранулоцити/лімфоцити. У
клінічно здорових кількість лейкоцитів у препараті становила 3-4 тисячі/мкл,
співвідношення гранулоцити/лімфоцити було 55-60/45-40 (%).
Як об’єкт фагоцитозу використовували вбиті нагріванням дріжджі виду
Debarіomyces hansenii (ВКМ Y-102) (культура люб’язно надана пров. науковим
співробітником Інституту біології клітини НАН України д.б.н. Д.В.Федорович).
Дріжджі культивували 48 годин на сусло-агаровому середовищі, осаджували
центрифугуванням, промивали дистильованою водою, обробляли ацетоном, діетиловим
етером і висушували. Для приготування суспензії наважку дріжджів розмішували у
воді з розрахунку 2 мг/мл, для дезінтеграціі клітинних агрегатів суспензію
протискали 8-10 разів через голку інсулінового шприца. Кількість дріжджових
клітин підраховували у гемоцитометричній камері під мікроскопом при збільшенні
40х10. Концентрація дріжджів становила 110-130 млн/мл. Як консервант до
суспензії дріжджів додавали 0,02 % азиду натрію. Приготовлені так
- Київ+380960830922