РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Враховуючи мету і завдання, поставлені в дисертаційній роботі, а також сучасні уявлення про актуальність дослідження впливу змін кислотно-лужного стану на показники мінерального обміну організму отруєних щурів 3-, 6- та 18-місячного віку, нами вибрано наступні методологічні підходи та біохімічні методи дослідження.
2.1. Відбір матеріалу та підготовка його для досліджень
Дослідження проводились на базі кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції, віварію Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва.
У дослідах було використано білих безпородних щурів науково-виробничого центру лабораторного тваринництва Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва різних вікових груп: 3- місячного віку (періоду статевого дозрівання, молоді); 6-місячного віку (періоду статевої зрілості, дорослі) і 18-місячного віку (періоду старості, старі). У процесі дослідної роботи використано 570 щурів.
Тварин утримували на стандартному раціоні віварію, який включав згодовування повнораціонного комбікорму виробника АОЗТ "Фенікс".
Отруєння щурів кожної вікової групи проводилось упродовж 14 діб щоденним внутрішньочеревним введенням кадмію сульфату, який попередньо розчиняли в 0,9 - му % розчині натрію хлориду, з розрахунку 0,134 мг/100г маси тіла тварини, що становило 1/50 LD50 [49, 160, 193 ]. Щурам інтактної групи за схемою досліду вводили відповідний об'єм
0,9 - го % розчину натрію хлорид.
Стан експериментального метаболічного ацидозу та алкалозу моделювали шляхом внутрішньочеревного введення амонію хлориду та натрію бікарбонату відповідно [121, 173 ]. Амонію хлорид використовували в 20 % концентрації з розрахунку 20 мг/100 г маси тіла тварини відповідно до кожної вікової групи. Щурам 3-місячного віку вводили 0,15 мл 20 % розчину амонію хлориду, 6-місячного віку - 0,2 мл, 18-місячного віку - 0,25 мл. Натрію бікарбонат використовували в концентрації 22,5 % з розрахунку
45 мг/100 г маси тіла тварини. Щурам 3-місячного віку вводили 0,3 мл
22,5 % розчину натрію бікарбонату, 6-місячного віку - 0,4 мл, 18-місячного віку - 0,5 мл.
Експериментальні дослідження на щурах кожної вікової групи проводилися за наступною схемою: I група - інтактні щури; II - щури, отруєні кадмію сульфатом; III - щури, отруєні кадмію сульфатом, а починаючи із 15 доби, введені у стан експериментального метаболічного ацидозу; IV - щури, які знаходились у стані експериментального метаболічного ацидозу, а починаючи із 15 доби, отруєні кадмію сульфатом; V - щури, отруєні кадмію сульфатом, а починаючи із 15 доби, введені у стан експериментального метаболічного алкалозу; VI - щури, які знаходились у стані експериментального метаболічного алкалозу, а починаючи із 15 доби, отруєні кадмію сульфатом.
Проведено 3 серії дослідів. У першій серії здійснювали:
- розробку біологічних моделей введення щурів, отруєних кадмію сульфатом, у стан експериментального метаболічного ацидозу та алкалозу;
- дослідження впливу стану експериментального метаболічного ацидозу та алкалозу на вміст Кадмію у крові, печінці, нирках, селезінці, серці та легенях отруєних щурів;
- вивчення впливу змін параметрів кислотно-лужного стану організму на вміст у крові Натрію, Калію, Кальцію, Магнію та неорганічного Фосфору, а також Купруму, Цинку, Феруму у крові та органах щурів 3-місячного віку, отруєних кадмію сульфатом.
У другій та третій серіях - проводили дослідження вказаних завдань для щурів 6- та 18-місячного віку.
По закінченню досліду щурам натщесерця проводили евтоназію методом декапітації під ефірним наркозом, після чого здійснювали забір крові для проведення біохімічних досліджень. Для визначення вмісту Кадмію, Купруму, Цинку та Феруму відбирали печінку, нирки, селезінку, серце й легені. Всі дослідження на тваринах проводили відповідно з правилами їх утримування та використання у дослідах [67].
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Визначення показників кислотно-лужного стану крові
У гепаринізованих пробах крові визначали показники кислотно-лужного стану на мікроаналізаторі газів Blood Gas Analyzer "Radelkis" (Угорщина) [3]. На приладі досліджували основні показники - величину рН, парціальний тиск вуглекислого газу і кисню - pCO2, pO2, величину зсуву буферних основ (ЗБО), концентрацію НСО3 - та загальної вуглекислоти
(CO2 заг.) у крові дослідних тварин.
2.2.2. Дослідження вмісту Кадмію, Купруму, Цинку та Феруму у крові та органах щурів
Вміст Кадмію, Купруму, Цинку та Феруму у крові, печінці, нирках, селезінці, серці, легенях визначали за допомогою спектрохімічного методу, використовуючи режим абсорбції на атомно-абсорбційному спектрофотометрі AAS-30 (Німеччина) [203, 210 ].
Зразки крові, печінки, нирок, селезінки, серця, легень відбирались згідно вимог [54]. Фарфорові тиглі з наважками розміщали на електроплитку та обережно проводили обвуглювання, не допускаючи сильного диміння. Після закінчення обвуглювання мінералізацію проб проводили у муфельній печі, поступово підвищуючи температуру на 50?С через кожні 30 хв. до температури 450?С. Мінералізацію вважали закінченою тоді, коли зола набувала білого кольору, без обвуглених часточок. При наявності обвуглених часточок повторювали обробку золи розчином азотної кислоти і продовжували озолення. Тиглі з золою після озолення охолоджували до кімнатної температури і змочували золу по краплям 56 % розчином азотної кислоти, яку розводили у співвідношенні 1:1.
Для визначення вмісту мінеральних елементів на атомно-абсорбційному спектрофотометрі ААS-30 готували розчини з певним розведенням [55].
В якості контрольних розчинів використовували стандартні зразки розчинів металів фірми "Альфарус" (Україна).
Дослідження вмісту Натрію, Калію, Кальцію, Магнію та неорганічного Фосфору у плазмі крові проводилось на біохімічному аналізаторі
"Microlab 200" (Н