Глава 2
Материалы и методы исследования
2.1. Современные биотехнологии в целенаправленном поиске
церебропротекторов
Научная стратегия поиска биологически активных соединений, в том числе и
церебропротекторов, на сегодня базируется на ряде приоритетных направлений,
среди которых, компьютерные технологии конструирования, генная инженерия,
медицинская и комбинаторная химия, молекулярное моделирование,
высокоэффективный тотальный скрининг и другие [102, 108, 128, 241]. Учитывая
это, нами совместно с группой синтетиков, руководитель профессор, д. фарм. н.
С. И. Коваленко, на первом этапе была сформирована виртуальная библиотека,
систематизированная с помощью пакета ISIS 2.4. На втором этапе проводился отбор
структур-кандидатов и выбор направлений исследований. Для обработки библиотеки
и отбора структур-лидеров использовалась компьютерная программа PASS C&T
(Prediction of Activity for Substanses: Complex and Training). Прогноз
биологической активности с использованием компьютерной программы PASS C&T
проведен в Институте молекулярной биологии и генетики НАН Украины (старш. науч.
сотр., к. хим. н. С. М. Ярмолюк). Биологическая активность в программе PASS C&T
оценивается качественным образом (да/нет). В результатах прогноза, кроме
выявленной активности, приводится вероятность каждого вида действия
(размерность от 0 до 1). Учитывались фармакологические активности, вероятность
которых превышала 50% (Pa > 0,500). Приведенная вероятность избрана в связи с
тем, что для производных 4-гидразинохиназолина база данных ограничена.
Учитывая тот факт, что одним из звеньев патогенеза нейродеструктивных
заболеваний является гиперпродукция активных форм кислорода (АФК), приводящая к
дальнейшей активации свободнорадикального окисления (СРО) и вызывающая каскад
необратимых нарушений в нейроиммуноэндокринных взаимодействиях, нами на третьем
этапе проведены исследования на антиоксидантную (АОА) и антирадикальную (АРА)
активность. В основе разнообразных методов in vitro заложен механизм
инициирования СРО. Необходимо отметить, что выбранные методы предоставляют
также возможность проводить одновременный скрининг значительного массива
синтезированных соединений. Кроме того, с помощью данных моделей можно провести
отсев значительного количества веществ и отобрать соединения-кандидаты с
высокой АОА и АРА, с учетом того, что они, как правило, будут проявлять и
выраженную биологическую активность.
На следующем, четвертом этапе, отобранные соединения-кандидаты оцениваются в
условиях моделирования ОНМК по типу ишемического инсульта, по таким показателям
как выживаемость животных, снижение неврологического дефицита, способность к
обучению и запоминанию, влияние на интенсивность СРО, АО-системы,
энергетический метаболизм тканей головного мозга.
Пятый этап – наиболее активное вещество (соединение-лидер) исследуется на
различных моделях ОНМК (двухсторонний фотоиндуцированный тромбоз сосудов лобной
доли коры головного мозга, ишемии-реперфузии головного мозга, ОНМК по типу
ишемического инсульта), где учитывается его влияние на неврологический и
когнитивный дефицит, динамику восстановления неврологического статуса, снижение
процессов СРО, активацию АО-системы, нормализацию показателей
углеводно-энергетического обмена, нормализацию морфологической картины в
сравнении с тиотриазолином, эмоксипином, пирацетамом.
2.2. Объекты и модели исследования
Экспериментальная часть выполнена на 890 белых крысах линии Вистар обоего пола,
массой 220-260 г. Все животные содержались на стандартном рационе питания
вивария, при естественной смене дня и ночи. Крысы получены из питомника ИФТ АМН
Украины. Все экспериментальные процедуры и оперативные вмешательства
осуществляли в соответствии с "Положением об использовании животных в
биомедицинских исследованиях" [48, 57, 142].
Поскольку нашей задачей стала оценка церебропротективной активности соединений,
то нам необходимы модели экспериментальной патологии головного мозга адекватные
клиническим ситуациям, таким как ишемический инсульт [23, 66, 96, 111, 132,
242]. С этой целью используют различные экспериментальные модели: одно- и
двустороннюю перевязку общих сонных артерий, временную окклюзию двух сонных
артерий на фоне необратимой перевязки двух позвоночных артерий. Указанным
требованиям соответствует двусторонняя перевязка общих сонных артерий в связи с
видовыми анатомо-физиологическими особенностями кровоснабжения головного мозга
белых крыс [23, 36, 133, 141, 167]. При этом наблюдается соответствующий
неврологический дефицит, когнитивные нарушения, гистологические и биохимические
изменения ткани головного мозга. Односторонняя перевязка общей сонной артерии у
крыс различных видов, являясь менее травматичной, сопровождается развитием
полноценного коллатерального кровообращения по сосудам виллизиева круга, и в
ткани мозга в полушарии на стороне окклюзии при этом не образуются обширные
ишемические очаги, характерные для ишемического инсульта [18, 66, 141, 171,
242]. Поэтому одностороннюю перевязку общей сонной артерии у крыс используют в
качестве экспериментальной модели ишемии мозга с целью оценки антиоксидантных и
противоишемических свойств соединений, а также для первичного скрининга
нейропротективной активности в большом ряду соединений [111, 132].
Односторонняя перевязка общей сонной артерии вызывает полную симптоматику
инсульта только у монгольских песчанок [96, 220, 244].
Также использовали общепринятые в данное время модели экспериментального
нарушения мозгового кровообращения: двусторонний фотоиндуцированный тромбоз
сосудов лобной доли к
- Київ+380960830922