РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Групування дослідів
Для вирішення поставлених у роботі завдань були проведені дослідження на 204
щурах лінії Вістар віком 4-5 місяців, 93 лабораторних мишах лінії СВА віком 6-8
тижнів та на крові 6 донорів та 6 пацієнтів з АБА віком 20-40 років.
Лабораторних тварин утримували в умовах віварію Української медичної
стоматологічної академії на типовому раціоні годування (раціон 3.2 згідно
наказу 1179 про нормативи годування лабораторних тварин в закладах охорони
здоров’я). Всі маніпуляції з тваринами проводились за дозволом біоетичної
комісії УМСА.
Дослідження імунної відповіді, індукованої алоантигенами та гетероантигенами,
проводили в експерименті. При цьому первинну та вторинну імунну відповідь
досліджували за реакцією регіональних лімфатичних вузлів у щурів після
імунізації алоантигенами та сингенними антигенами. Первинну та вторинну
гуморальну імунну відповідь досліджували у мишей за стандартною методикою
визначення специфічних антитіл до гетероантигенів, а саме титр гемаглютинінів
та гемолізинів імунізованих тварин [104].
Антигенним матеріалом для імунізації щурів алоантигенами та сингенними
антигенами слугувала суспензія алоспленоцитів щурів, відповідно, тварин даної
лінії (представники різних інбредних ліній) або суспензія спленоцитів одного з
батьків для тварин першого покоління, виділених в асептичних умовах за
стандартною методикою [105, 106]. Рівень життєздатності клітин визначали за
методикою з трипановим синім [106, 107]. Імунізацію експериментальних тварин
проводили шляхом одноразового введення в пучку однієї задньої кінцівки зависі
алоспленоцитів або сингенних спленоцитів в дозі 5?106 клітин в 0,1 мл
стерильного фосфатно-сольового буферу (ФСБ). Аналогічно проводили реімунізацію
з інтервалом в 30 днів для дослідження вторинної імунної відповіді. Первинну
імунну відповідь досліджували на 7 добу після імунізації та вторинну імунну
відповідь на 5 добу після реімунізацї за реакцією регіональних лімфатичних
вузлів, яка дозволяла за розмірами останніх судити про активність реакції
відторгнення алогенного трансплантату та реакції трансплантат проти хазяїна
(РТПХ) [108]. Для контролю використовували стерильний ФСБ та попередньо
прогріті спленоцити при 56?С протягом 30 хвилин. При цьому рівень
життєздатності клітин після прогрівання не перевищував 3% за методикою з
трипановим синім.
В якості гетероантигенів для дослідження гуморальної імунної відповіді
використовували суспензію еритроцитів барана (вир-во НВЛ “Гранум”, м.Харків).
Мишей імунізували внутрішньоочеревно суспензією еритроцитів барана у 0,15М
розчині хлориду натрію в дозі 2?108 клітин на тварину [109]. Відповідно, для
дослідження первинної та вторинної імунної відповіді на гетероантигени кров
експериментальних тварин отримували через 6 днів після первинної імунізації та
на 5 добу після реімунізації (з інтервалом 30 днів) [110]. Кров тварин забирали
з правого шлуночка серця під ефірним наркозом з подальшим отриманням сироватки
та проведеннням досліджень.
Згідно методичного підходу, тварини дослідних груп отримували фармакологічні
препарати: блокатор цистЛТР – монтелукаст натрію (“Сингуляр”, MSD, США) в дозі
0,015мг, 0,15 мг та 1,5 мг на кг маси тварини або селективний антагоніст Н1
рецепторів – дезлоратадин (“Еріус”, Шерінг-Плау, США) в дозі 0,007 мг, 0,07 мг
та 0,7 мг на кг маси тварини. Дози препаратів підбирались на основі
середньотерапевтичних доз у перерахунку на 1 кг маси [111, 112, 113]. Препарати
вводили перорально з інтервалом 24 години протягом всього періоду імунізації.
З метою вирішення поставленої задачі – вивчення in vivo впливу дезлоратадину
на алергенспецифічний апоптоз CD4+CD25+ Трег клітин хворих з АБА під
спостереженням знаходилось 6 пацієнтів віком 20-40 років на АБА легкої та
середньої ступені важкості в період ремісії, сенсибілізованих алергенами
домашнього пилу, які знаходились на лікуванні в пульмонологічному відділенні
1-ої Міської клінічної лікарні та склали основну групу. Відповідно, 6 практично
здорових осіб складали групу порівняння. Вибірки пацієнтів були врівноважені за
віком та статтю.
Діагноз БА був встановлений на основі анамнестичних, клінічних даних,
результатах лабораторних і функціональних методів обстеження та критеріїв
ефективності протиастматичної терапії.
Сенсибілізацію алергенами домашнього пилу діагностували на підставі комплексу
алергологічних методів обстеження: збір алергологічного анамнезу, позитивного
шкірного скарифікаційного тесту з алергенами домашнього пилу, збагаченого
дерматофагоїдними кліщами (Dermatofagoides farine) (виробництва МП “Імунолог”,
м. Вінниця, Україна). Скарифікаційні тести з алергеном ставили на внутрішній
поверхні предпліччя паралельно з тест-контрольною рідиною та 0,01% розчином
гістаміну з інтервалом у 2 см послідовно від ліктя. Результати проб оцінювали
через 15-20 хвилин. Реакцію на алерген вважали специфічною лише при відсутності
реакції на тест-контрольну рідину та при наявності позитивної реакції на
гістамін. Реакція оцінювалася за розмірами гіперемії та пухирця [1].
Із дослідження виключалися хворі із важким перебігом БА, а також пацієнти, які
отримували системні та інгаляційні кортикостероїди протягом останніх двох
місяців. З метою виконання поставлених у роботі завдань пацієнти основної групи
отримували антигістамінний препарат 2-покоління – дезлоратадин, ендогенний
метаболіт лоратадину (“Еріус”, Шерінг-Плау, США) перорально один раз на добу у
дозі по 5 мг протягом 10 днів [112, 114]. Під час клінічного спостереження
дозволялося застосовувати в2-агоністи короткої дії.
- Київ+380960830922